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Effects of Sagan-tang and individual herbs on COPD Mice Model
Effects of Sagan-tang and individual herbs on COPD Mice Model
Herbal Formula Science. 2015. Dec, 23(2): 171-187
Copyright © 2015, The Korean Academy of Oriental Medicine prescription
This paper is available at http//:www.formulastudy.com which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
  • Received : September 14, 2015
  • Accepted : December 08, 2015
  • Published : December 31, 2015
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종민 한
원경 양
승형 김
양춘 박
omdpyc@dju.kr

Abstract
Objective
This study aimed to evaluate the effects of Sagan-tang (SGT) on COPD mouse model.
Methods
The study was carried out by two ways (in vitro, in vivo). In vitro RAW264.7 cells (mouse macrophage) were used and analysed by flow cytometry, ELISA, Western blot. In vivo LPS and CSS challenged mice were used and its BALF had been analysed by cytospin image, FACS, ELISA, lung tissue by real-time PCR.
Results
In vitro, SGT maintained 80-100% rate of viablilty on 10 ~ 500 ㎍/㎖ concentration. In ELISA analysis with RAW264.7 cells, SGT significantly decreased NO over 30 ㎍/㎖. In flow cytometry, SGT 100 ㎍/㎖ dosage group displayed a tendency for decrease ROS. In Western blot analysis, SGT 100 ㎍/㎖ dosage group decreased NF-κB. In ELISA analysis, SGT significantly decreased TNF-α, IL-6 over 200 ㎍/㎖. In vivo SGT 200 ㎎/㎏ dosage group, application of SGT significantly decreased increase of neutrophils, TNF-α, IL-6 in BALF, muc5AC, TGF-β, TNF-α, expression of mRNA in lung tissue and histological lung injury.
Conclusion
This Study suggests usability of SGT for COPD patients by controlling lung tissue injury.
Keywords
I. 서 론
만성폐쇄성폐질환 (Chronic Obstructive Pulmonary Disease; COPD)은 만성적인 기침과 객담, 호흡곤란을 주 증상으로 하고 기도와 폐실질, 혈관계의 만성염증을 특징으로 하는 대표적인 만성 염증성 호흡기 질환의 하나이다 1 . COPD의 발생에 영향을 끼치는 위험인자는 연령, 성별, 교육수준, 흡연양 등으로 이 중 흡연량의 경우 20갑년 이상의 흡연자가 비흡연자에 비해 유병률이 1.97배에 달할 정도로 가장 주요한 위험인자이다 2 . 한편 우리나라는 2011년 청소년 평균 흡연 최초연령은 13.9세, 흡연율은 12.1%로 3 타 OECD국가에 비해 높은 흡연율과 점차 낮아지는 최초 흡연연령을 보이고 있어 4 지속적인 COPD 환자의 증가를 예측할 수 있다. 실제로 2012년 40세 이상 남성의 국내 COPD 유병률은 23.4%로 2009년부터 꾸준히 증가하고 있으며 5 , 전 세계적으로도 주요 사망원인 질환 중에서 COPD는 특이하게 유병률과 사망률이 증가하는 추세를 보이고 있어 6 , 인류 건강의 주요 과제로 부각되고 있다.
COPD의 치료는 Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) 가이드라인에서 기관지확장제 위주의 처방이 권고되고 있으나 7 이러한 약제들 역시 비가역적인 기류제한의 진행을 효과적으로 지연시키거나 소기도 또는 폐 실질의 염증을 효과적으로 제어하지 못하고 있는 실정이다 8 . 따라서 COPD 환자의 예후를 향상시키면서 장기적으로 관리할 수 있는 좀 더 효과적인 제제의 개발이 요구되고 있다.
COPD는 한의학적으로는 咳嗽證, 肺脹證, 喘證, 哮喘의 범주에 해당하여 健脾益腎, 益氣定喘, 補腎陰陽하는 치법을 사용한다 9 . 기존의 COPD에 대한 한방치료의 효과를 평가한 연구로는 小靑龍湯 (xiǎoqīngl ng-tāng) 10,11 , 麥門冬湯 (m im ndōng-tāng) 12 , 生脈淸肺飮 13 , 淸上補下湯에서 유래한 PM014 14 등의 처방과 金銀花 15-17 , 蜂毒 18 , 麥門冬 19 의 단미 연구가 있다. 사간탕 (射干湯)은 성제총록 (聖濟總錄) 20 에 기재되어 上氣喘息 如水鷄聲에 사용하는 처방으로 대전대학교부속한방병원 폐계내과에서 COPD를 비롯한 만성호흡기질환에 다용하고 있고 동물모델을 이용하여 그 효과를 평가하였다.
본 연구에서는 COPD에 대한 사간탕의 효과를 위하여 RAW264.7 cell line을 이용한 in vitro실험을 진행하여 MTT assay를 통해 세포독성을 분석하였고, 유세포분석, Western blot, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)를 통해 항염증 반응을 평가하였다. 또한 LPS와 표준 담배추출물 (Cigarette Smoke Solution: CSS)로 COPD를 유발한 생쥐동물모델 21 을 이용한 in vivo실험을 수행하여 유세포분석, ELISA를 통하여 면역세포, 염증 cytokine 생성수준을 분석하였고, real-time PCR을 통해 연관 유전자의 발현정도를 평가하였으며, lung biopsy로 폐 조직 손상에 대한 사간탕의 작용을 확인하였다. 본 실험결과 사간탕의 폐 손상에 대한 염증 사이토카인 및 관련 유전자 발현억제 및 폐 조직 보호효과를 확인하였기에 이에 보고하는 바이다.
II. 실 험
- 1.재료
- 1) 약재
사간탕 (Sagan-tang; SGT)의 구성 약재는 (주) 휴먼허브(Gyeongbuk, Korea)에서 지원받아 사용하였으며, 1첩의 내용과 용량은 table 1 과 같다. 사간탕 2첩 분량 (36 g) 또는 동량의 개별 약물에 각각 증류수 800 ㎖를 가하여 환류 추출기에서 3시간 동안 가열하여 얻은 액을 여과하였다. 이를 감압 증류장치 (Buchi B-480, Switzer land)로 농축하고, 다시 동결 건조기(Eyela FDU-540, Japan)를 이용하여 완전 건조한 추출물을 냉동 (−84℃) 보관하면서 사용하였다. 최종적으로 사간탕은 초기 약재 36 g으로부터 4.23 g의 추출물을 얻어 11.75%의 수율을 나타내었고, 射干, 半夏, 桂枝, 生薑은 각각 10.3, 12.4, 9.7, 13.6%의 수율을 나타냈다.
The Composition of Sagan-tang (SGT)
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The Composition of Sagan-tang (SGT)
- 2) 시약 및 기기
본 실험에 사용한 lipopolysaccharide (LPS)는 Sigma사(USA)에서 구입하였으며, 1 ㎎/㎖의 농도로 증류수에 녹여 사용 전까지 −20℃에서 보관하였다. 그 밖에 mouse Tumor necrosis factor- α (TNF- α , eBioscience, USA), mouse Interleukin-6 (IL-6, eBioscience, USA), mouse Macrophage inflammatory protein 2 (MIP 2, eBiosci ence, USA), mouse Chemokine (C-X-C motif) ligand-1 (CXCL-1 , eBioscience, USA) 등을 사용하였다.
본 실험에 사용된 시약은 lipopolysaccharide (LPS), Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), formaldehyde, RPMI-1640 배양액은 Sigma사 (USA) 제품을, Fetal Bovine Serum (FBS)는 Hyclone사 (USA) 제품을, TNF- α , IL-6, MIP2, CXCL-1 ELISA kit는 eBioscience사 (USA) 제품을 사용하였으며, 기타 일반 시약은 특급을 사용하였다.
기기는 열탕추출기 (대웅, Korea), rotary vacuum evaporator (B chi, Switzerland), freeze dryer (EYELA, Japan), chemical balance (Cas, Korea), CO2 incubator (Forma Scientific, USA), clean bench (Vision Scientific, Korea), autoclave (Sanyo, Japan), micro-pipet (Gilson, France), water bath (Vision scientific, Korea), vortex mixer (Vision scientific, Korea), spectrophotometer (Shimazue, Japan), Biosystem XA (Buxco Research System, USA), centrifuge (Sigma, USA), deep-freezer (Sanyo, Japan), thermocycler system (MWG Biotech, Germany), ice-maker (Vision scientific, Korea), chemical balance (Cas, Korea), homogenizer (OMNI, USA), plate shaker (Lab-Line, USA) 및 ELISA reader (Molecular Devices, USA) 등을 사용하였다.
- 2. 방법
- 1) Invitro실험
- (1) RAW264.7 세포
실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 mouse macrophage로 한국세포주 은행 (Seoul, Korea)에서 분양받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) 배지를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 공급 조건에서 배양하였다.
- (2) 세포 독성
사간탕과 구성 약물로서 射干, 半夏, 桂枝, 生薑의 세포에 대한 독성 측정은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol 2-yl)-2,5-diphenyl tetra zolium bromide) (Sigma, USA) 측정으로 분석하였다. 이 방법은 MTT가 formazan으로 전환되는 것을 측정하는 것으로, 96 well plate에 2×104 cells/well의 RAW 264.7 세포를 분주하고 사간탕과 구성 약물 추출물을 각각 농도별(10, 30, 50, 100, 300, 500 ㎍/㎖)로 24시간 및 48시간 동안 처리하였다. Well 당 100 ㎕의 MTT용액을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader (VERSAmax, Molecular Devices, USA)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다. 사간탕과 구성 약물 추출물의 각 농도별 흡광도는 세포를 뺀 배지를 같이 배양하여 대조군과 실험군을 비교해서 보정하였다.
- (3) 항염증 분석
- ① Nitric Oxide (NO) 측정
NO의 발현에 미치는 영향을 측정하기 위해 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)를 수행하였다. 전처치로 각 농도 (10, 30, 50, 100, 300, 500 ㎍/㎖)의 사간탕과 사간탕 구성약물 추출물을 각 농도당 3 well씩 30분간 처리하였고 이후 24시간 동안 LPS (400 ng/㎖)를 처리하였다. 배양 이후에 capture antibody를 coating buffer에 혼합하여 각각의 well당 100 ㎕씩 넣고, 4℃에서 overnight한 후, washing buffer로 4회 세척하였다. Assay diluent를 well당 200 ㎕씩 넣고, 실온에서 1시간 동안 blocking을 한 후, washing buffer로 4회 세척하였다. 각 실험군을 assay diluent 용액에 2-10배의 농도로 희석한 후, 각각의 capture antibody로 coating된 96 well plate에 100 ㎕씩 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. Washing buffer로 4회 세척하고, biotin-conjugate antibody reagent를 각각의 well에 100 ㎕씩 처리하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 4회 세척한 다음, streptavidine-HRP solution을 각각의 well에 100 ㎕씩 처리하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 다시 washing buffer로 4회 세척하였다. 여기에 substrate solution을 100 ㎕씩 처리하여 20분간 반응시킨 후, 50 ㎕의 stop solution을 처리하여 반응을 종결시킨 뒤 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- ② Reactive Oxygen Species (ROS) 측정
ROS의 발현에 미치는 영향을 측정하기 위해 유세포 분석 (flow cytometry)을 실시하였다. 전처치로 LPS (400 ng/㎖) 유무하에서 24시간동안 각각의 사간탕 구성약물 및 사간탕 추출물을 100 ㎍/㎖로 투여하였고, 양성대조물질 cyclosporin A (CsA)은 10 ㎍/㎖로 처리하였다. 배양 이후엔 DCFH-DA reagent (50 μ M)를 처리하여 37℃ water bath에서 5 분간 배양한 후 유세포 분석을 실시하여 형광강도에 따른 세포수를 측정하였다.
- ③ Nuclear Factor kappa B (NF-κB) 측정
NF- κ B 발현에 미치는 영향을 측정하기 위해 Western blot이 수행되었다. CsA 10 ㎍/㎖와 사간탕, 사간탕 구성약물 추출물 100 ㎍/㎖을 1시간 동안 투여하였고, 이후 LPS 100 ng/㎖을 24시간 동안 처리하였다. 배양 이후엔 lysis buffer를 첨가한 후 일부 용해물은 Nuclear Factor of Activating T cells (NFAT) protein과 함께 western blot을 시행하였고, 남은 용해물은 직접 Sodium dodecylsulfate-Polyacryl amide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 및 indicated antibodies를 이용한 면역블로팅법 (immuno–blotting)을 수행하였다. 이후 internal control로 YY-1 protein에 대한 상대밀도를 측정하였다.
- ④ Inflammatory cytokine (TNF-α, IL-6) 측정
사간탕과 구성 약물이 LPS를 처리한 RAW264.7 세포에서 TNF- α , IL-6의 발현에 미치는 영향을 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. CsA 10 ㎍/㎖와 사간탕 구성약물 추출물 200 ㎍/㎖, 사간탕 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖을 각각 2 well씩 1시간 동안 투여하였고, 이후 LPS 100 ng/㎖을 24시간 동안 처리하였다. 이후 capture antibody를 coating buffer에 혼합하여 각각의 well당 100 ㎕씩 넣고, 4℃에서 overnight한 후, washing buffer로 4회 세척하였다. Assay diluent를 well당 200 ㎕씩 넣고, 실온에서 1시간 동안 blocking을 한 후, washing buffer로 4회 세척하였다. 각 실험군을 assay diluent 용액에 2-10배의 농도로 희석한 후, 각각의 capture antibody로 coating된 96 well plate에 100 ㎕씩 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. Washing buffer로 4회 세척하고, biotin-conjugate antibody reagent를 각각의 well에 100 ㎕씩 처리하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 4회 세척한 다음, streptavidine-HRP solution을 각각의 well에 100 ㎕씩 처리하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 다시 washing buffer로 4회 세척하였다. 여기에 substrate solution을 100 ㎕씩 처리하여 5-30분간 반응시킨 후, 50 ㎕의 stop solution을 처리하여 반응을 종결시킨 뒤 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 2) Invivo실험
- (1) 동물
실험동물은 BALB/c 계열의 7주령 수컷 생쥐 (대한바이오링크, Korea) 로서 고형 사료와 물을 제약 없이 섭취하도록 하였으며, 온도는 22-24oC, 습도는 50±10%가 유지되도록 하고, 조명은 밤낮 주기 (12시간 주/야)가 조절되는 실험실 환경에서 사육하였다. 실험동물의 평균 체중은 23.9±0.82 g이었다. 본 실험은 대전대학교 동물실험윤리위원회의 규정에 따라 시행되었다 (승인번호: DJUARB2014-008).
- (2) CSS의 제조
- ① 표준담배 연기의 포집
표준담배 Coresta Monitering Cigarette 7 (CM7, Heinr Borgwaldt, Germany)의 연기응축물 포집은 ISO3402 규정 22 에 의거하여 흡연실 온도 22±2℃, 상대습도 60±5%에서 실시하였으며, ISO3308 규정22에 의거하여 자동흡연장치 (RM20/CS, Heinr Borgwaldt, Germany)를 이용하여 흡연부피 35.0±0.3 ㎖, 흡연주기 60±0.5 초, 흡연시간 2.00±0.02 초, 꽁초길이 3 ㎜ 이상으로 표준담배를 연소시키고, 92 ㎜ cambridge filter (USA)로 담배연기 응축물을 포집하였다.
- ② 표준담배 연기응축물 추출
담배연기응축물이 포집된 camberidge filter를 cigarette holder (RM20, Heinr Borgwaldt, Germany)에서 분리하여 각각 100㎖ 삼각플라스크에 넣고 추출용매 isopropanol 50 ㎖씩을 가하여 잘 흔든 다음, 실온에서 8시간 이상 방치하여 추출하였다. 추출 후 여과하고 감압여과 농축기로 농축하였으며 3개의 삼각플라스크에 들어있는 농축액을 scintillation vial rack (WHEATON 03-340-25N, USA)에 모으고 질소 가스를 이용하여 완전 농축하였다. 표준담배 주류연 (主流煙) 중 Total Particulate Matter (TPM)의 함량은 Fig.1 을 이용하여 계산하였다.
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Total Particulate Matter of Cigarette Smoke Solution. WFHA: Weight of filter holder after smoke, WFHB: Weight of filter holder before smoke, N: Cigarette number of each trap.
- (3) 폐손상 모델
7주령 BALB/c 수컷 생쥐에 대해 LPS 100 ㎍/㎖와 표준담배 추출물 (Cigarette smoking solution: CSS) 4 ㎎/㎖을 1:1로 섞어 주 1회씩 3주간 코와 입을 통하여 50 ㎕씩 총 100㎕를 흡인시켜 COPD를 유발시켰다. LPS와 표준담배 추출물은 7% Chloral hydrate (C8383, Sigma, USA)를 복강 주사하여 마취를 약간만 시켜 움직임이 없는 생쥐의 앞니를 고무밴드로 고정시킨 상태에서 투여되었다. 실험군은 (i) 아무런 처리를 하지 않은 정상군 (Normal), (ii) LPS와 표준담배 추출물을 처리한 대조군 (Control), (iii) LPS와 표준담배 추출물을 처리한 후 dexamethasone (3 ㎎/kg, p.o.) 투여한 양성 대조군 (Positive control), (iv) LPS와 표준담배 추출물을 처리한 후 射干 추출물 (200 ㎎/㎏, p.o) 투여군 (BR), (v) LPS와 표준담배 추출물을 처리한 후 半夏 추출물 (200 ㎎/㎏ p.o) 투여군 (PT), (vi) LPS와 표준담배 추출물을 처리한 후 桂枝 추출물 (200 ㎎/㎏ p.o) 투여군 (CR), (vii) LPS와 표준담배 추출물을 처리한 후 生薑 추출물 (200 ㎎/㎏ p.o) 투여군 (PT), (viii) LPS와 표준담배 추출물을 처리한 후 사간탕 추출물 (200 ㎎/㎏ p.o) 투여군 (SGT)으로 나누었다. 약물을 투여하는 각각의 실험군은 14일간 매일 경구투여 하였고, 실험이 끝난 후 각군 생쥐의 기관지 폐포 세척액 (Bronchoalveolar lavage fluid: BALF) 및 폐조직을 분리하였다( Fig. 2 ).
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Experimental Plan of Repeated LPS+CSS Exposure.
- (4) 기관지폐포 세척액 분리
실험 마지막 날 채혈한 후, 개흉하여 기도를 노출시켜 FBS free DMEM 배지 1 ㎖을 넣은 주사기를 기도 내로 삽입하고 끈으로 묶어 고정한 후 기관지 폐포세척을 3회 순환하여 세척액 (BALF)을 얻었다. 기관지 폐포 세척액을 4℃, 2,000 rpm, 5분간 원심분리 한 후, 상층액은 cytokine을 측정하기 위해 냉동보관하고, BALF에서 분리한 세포는 ACK 용액을 3분 동안 처리하여 적혈구를 용해시키고 다시 1% FBS free DMEM 배양액으로 세척한 후, hemocytometer를 사용하여 총 세포수를 측정하였다.
- (5) 기관지폐포 세척액 내 총 호중구 세포수 측정
호중구 (neutrophil)의 BALF 내 세포계수를 위해 cytospin 시행 후 침전된 혈구를 분리하여 Diff-Quick staining (Romanowsky stain)을 3회에 걸쳐 처리하였다. 이후 PBS로 2회 세척한 후 군당 9개의 slide를 제작하여 400배율의 광학현미경 (Light microscope, Nikon, Japan)을 통해 계수하였다.
- (6) 기관지폐포 세척액 내 면역형광세포 염색
BALF내 CD4+과 CD8+ 세포수 분포를 측정하기 위하여 BALF에서 분리한 세포를 4℃에서 면역형광염색 (immunofluorescence stain ing)을 실시하여 각각에 anti-CD4-Fluorescein isothiocyanate (FITC), anti-CD8-Phycoerythrin (PE)를 넣고, 30분간 4℃에서 반응시켰다. 반응 후 2회 이상 PBS로 세척한 후 flow cytometer의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 CD4+과 CD8+ 세포수를 백분율 (%)로 분석하였다.
호중구 (neutrophil)의 BALF내 세포수 분포를 측정하기 위하여 BALF에서 분리한 세포를 4℃에서 면역 형광염색 (immunofluore scence staining)을 실시하여 각각에 anti-CD11b-FITC, anti-Gr-1 -PE를 넣고, 30분간 4℃에서 반응시켰다. 반응 후 2회 이상 인산완충 생리식염수로 세척한 후 flow cytometer의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 CD11b+/Gr-1+ 세포수를 백분율 (%)로 분석하였다.
- (7) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
BALF 내의 TNF- α , IL-6, MIP2, CXCL-1의 양을 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. Capture antibody를 coating buffer에 혼합하여 각각의 well당 100 ㎕씩 넣고, 4℃에서 overnight한 후, washing buffer로 4회 세척하였다. Assay diluent를 well당 200 ㎕씩 넣고, 실온에서 1시간 동안 blocking을 한 후, washing buffer로 4회 세척하였다. 각 실험군의 혈청 및 standard를 assay diluent 용액에 10배의 농도로 희석한 후, 각각의 capture antibody로 coating된 96 well plate에 100 ㎕씩 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. Washing buffer로 3회 세척하고, biotin-conjugate antibody reagent를 각각의 well에 100 ㎕씩 처리하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 2회 세척한 다음, streptavidine-HRP solution을 각각의 well에 100 ㎕씩 처리하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 다시 washing buffer로 2회 세척하였다. 여기에 substrate solution을 100 ㎕씩 처리하여 20분간 반응시킨 후, 50 ㎕의 stop solution을 처리하여 반응을 종결시킨 뒤 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- (8) Real-time Polymerase chain reaction 분석
MUC5AC, TNF- α , 그리고 TGF- β mRNA 발현을 측정하기 위해 폐조직(lung tissue)에서 real-time PCR을 수행하였다. 생쥐의 폐조직을 적출한 후에 RNAzol (CS-105B, Tel-Test, USA) 500 ㎖를 넣고 용해될 때까지 분쇄하였다. 이 혼합 부유액에 chloroform (CHCl3) 50 ㎖를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 얼음에 15분간 방치한 후 13,000 rpm에서 원심분리 한 후 약 200㎖의 상층액을 회수하여 2-propranol 200㎖와 동량 혼합 후 천천히 흔들고 얼음에서 15분간 방치하였다. 이를 다시 13,000rpm에서 원심 분리한 후 80% EtOH로 수세하고 3분간 vacuum pump (ULVAC, USA)에서 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 diethy pyrocarbonate (DEPC, IBS-BW1004, Intron, Korea)를 처리한 20㎖의 증류수에 녹여 heating block (2050, Lab-Line, India) 75℃에서 불활성화시킨 후에 first cDNA합성에 사용하였다.
역전사(reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA 2㎍을 DNase Ⅰ (10U/㎖) 2U/tube를 37℃ heating block에서 30분간 반응한 후 75℃에서 10분간 변성시키고, 이에 2.5㎖ 10mM dNTPmix (4026,4027,4028,4029, TaKaRa, Japan), 1㎖ 100mM DTT (P1171, Promega, USA), 4.5㎖ 5×RT buffer (M531A, Promega, USA, 250mM Tris-HCl, pH 8.3, 375mM KCl, 15mM MgCl2)를 가한 후, 1㎖의 M-MLV RT (200U/㎖, M1705, Promega, USA)를 다시 가하고 diethyl pyrocarbonate (DEPC)가 처리된 증류수로서 최종 부피가 20㎕가 되도록 하였다. 이 20 ㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000rpm에서 5초간 원심침강하여 37℃ heating block에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 real-time PCR에 사용하였다.
합성한 cDNA를 Applied Biosystems 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 real-time PCR을 수행하였다. 사용된 muc5AC, TGF- β , TNF- α primer는 Power SYBR Green PCR Master Mix을 사용하였으며 ABi (USA)사에서 제공받아 사용하였다. 대조군은 생쥐 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) probe (Applied Biosystems, USA)를 사용하였다. Primer 및 probe의 sequence는 Table 2 와 같다. 반응액으로는 Taqman PCR Master mix를 사용하였고, probe의 최종농도가 200nM이 되게 반응시켰다. Real time quantitative PCR의 조건으로는 pre-denaturation은 50℃에서 2분, 94℃에서 10분, 그리고 40cycles은 95℃에서 15 초, 60℃에서 1분 수행하였다. 사간탕 투여군과 대조군은 internal standard로 G3PDH를 사용하여 target group의 Quantitative PCRy=x(1+e)n, x = starting quantity, y=yield n=number of cycles e = efficiency로 계산하여 relative quantitative (RQ)를 측정하였다.
Sequence of Mouse RT-PCR Oligonucleotide
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Sequence of Mouse RT-PCR Oligonucleotide
- (9) Hematoxylin & Eosin 염색
폐조직의 병리적 손상정도를 관찰하기 위해 폐조직을 절취하여 10% neutral buffered formalin에 24시간 동안 고정 시킨 다음 graded alcohol로 탈수시키고 파라핀으로 포매하여 block을 제작한 다음 microtome으로 4㎛ 두께의 조직절편을 제작하여 hematoxylin & eosin(H&E) 염색을 사용하였다. H&E staining을 실시하기 위하여 슬라이드를 hematoxylin에 1분 동안 담가 둔 후 흐르는 증류수에 여러 번 세척 후 eosin에 30초간 담그고 흐르는 증류수로 여러 번 세척하였다. 그 다음 70%→95%→100% ethanol에 여러 번 씻으며 염색을 적당히 제거한 후 xylene에 1분간 담가두었다. 마지막으로 mounting medium xylene을 이용하여 cover-slide를 영구 부착하였으며, 이러한 샘플들은 200배율의 광학현미경 (Light microscope, Nikon, Japan)을 통해 관찰하였다.
- 3) 통계분석
실험 집단 간 수치 데이터는 SPSS software (version 12.0, SPSS Inc., USA)에서 독립표본 T검정을 이용하여 비교분석하였다. p 값이 0.05, 0.01 혹은 0.001 보다 작은 경우를 구분하였고 각 경우가 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
III. 결 과
- 1. Invitro
- 1) 세포독성
RAW264.7 세포에 사간탕과 구성 약물 각각을 10 ㎍/㎖에서 500 ㎍/㎖ 농도범위로 처리한 결과, 세포생존율은 半夏 추출물 300 ㎍/㎖를 24시간 처리하였을 때 79.28%를 나타낸 것을 제외하고 아무것도 처리하지 않은 정상군에 비해 80-100%의 생존율 범위를 유지하여 세포독성을 나타내지 않았다( Fig. 3 ).
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Cytotoxicity of SGT and Individual Herbs on Proliferation of RAW264.7 Cells. RAW264.7 cells were treated with various concentrations of SGT and individual herbs (Belamcandae Rhizoma: BR, Pinellia Tuber: PT, Cinnamomi Ramulus: CR, Zingiberis Rhizoma: ZR) for 24 hr (A) or 48 hr (B), and harvested for MTT assay.
- 2) NO 생성에 미치는 영향
LPS를 처리한 대조군의 NO는 51.54±0.53 μ M로 나타나 정상군의 0.62±0.07 μ M보다 유의하게 증가하였다. 대조군에 비해 射干, 生薑의 모든 농도 및 半夏 500 ㎍/㎖에서 유의하게 감소하였고, 30 ㎍/㎖을 제외한 桂枝의 모든 농도에서 유의성 있게 감소하였으며, 사간탕은 30 ㎍/㎖ 이상을 투여한 실험군에서 모두 유의성 있게 감소하였다( Fig. 4 ).
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Effects of SGT and Individual Herbs on NO Production of LPS Induced RAW264.7 Cells. RAW264.7 cells were administrated LPS (Control, 400ng/㎖), and then treated with Belamcandae Rhizoma (BR), Pinellia Tuber (PT), Cinnamomi Ramulus (CR), Zingiberis Rhizoma (ZR) and SGT for 10 to 500㎍/㎖. All values are mean±SD. †: Significantly different from the non-treated group (††† p<0.001). *: Significantly different from the LPS-stimulated group (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
- 3) ROS생성에 미치는 영향
LPS를 처리한 대조군의 세포는 정상군보다 높은 형광강도에서 세포수 peak를 형성하였고, LPS 에 사간탕 및 射干, 半夏, 桂枝, 生薑 (100 ㎍/㎖)을 처리한 군과 양성대조군인 CsA를 처리한 군은 대조군보다 낮은 형광강도에서 peak를 형성하였다( Fig. 5 ).
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Effects of SGT and Individual Herbs on ROS Production of LPS Induced RAW264.7 Cells. RAW264.7 cells were treated LPS (Control, 400 ng/ml) and plus CsA (Cyclosporin A, 10 ㎍/㎖), plus PT (Pinellia Tuber, 100 ㎍/㎖), plus ZR (Zingiberis Rhizoma, 100 ㎍/㎖), plus BR (Belamcandae Rhizoma, 100 ㎍/㎖), plus CR (Cinnamomi Ramulus, 100 ㎍/㎖), and plus SGT (100 ㎍/㎖): LPS-SGT.
- 4) NF-κB생성에 미치는 영향
LPS를 처리한 대조군 NF- κ B의 YY-1에 대한 상대 밀도는 4.13으로 나타나 정상군의 2.5보다 증가하였다. 대조군에 비하여 양성대조군은 0.47로 감소하였고, 射干, 半夏, 桂枝, 生薑 및 사간탕 100 ㎍/㎖을 투여한 실험군에서 각각 1.41, 3.21, 1.21, 2.21, 1.42로 감소하였다( Fig. 6 ).
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Effects of SGT and Individual Herbs on NF-kB Production of LPS Induced RAW264.7 Cells. (A) NF-kB p65 Density (B) After 24h Expressions of NF-kB p65 were Carried out by Western Blot Analysis. RAW264.7 cells were administrated LPS (Control, 100ng/㎖), and then treated with Cyclosporin A (CsA, 10 ㎍/㎖), Belamcandae Rhizoma (BR, 100 ㎍/㎖), Pinellia Tuber (PT, 100 ㎍/㎖), Cinnamomi Ramulus (CR, 100 ㎍/㎖), Zingiberis Rhizoma (ZR, 100 ㎍/㎖) and SGT (100 ㎍/㎖).
- 5) TNF-α 생성에 미치는 영향
LPS를 처리한 대조군의 TNF- α 는 10354.50±358.3 pg/㎖로 나타나 정상군의 0.00±0.0 pg/㎖보다 유의하게 증가하였다. 대조군에 비하여 양성대조군인 CsA 투여군에서 3948.32±209.0 pg/㎖, 射干, 生薑 200㎍/㎖ 및 사간탕 200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800㎍/㎖을 투여한 실험군에서 각각 6579.75 ±103.2 pg/㎖, 6779.25±937.2 pg/㎖, 6873.10±311.7 pg/㎖, 5298.05±594. 4 pg/㎖, 2809.90 ±511.2 pg/㎖로 유의성 있게 감소하였다( Fig. 7 ).
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Effects of SGT and Individual Herbs on TNF-α Production of LPS Induced RAW264.7 Cells. RAW264.7 cells pretreated with Cyclosporin A (CsA, 10 ㎍/㎖), Belamcandae Rhizoma (BR, 200 ㎍/㎖), Pinellia Tuber (PT, 200 ㎍/㎖), Cinnamomi Ramulus (CR, 200 ㎍/㎖), Zingiberis Rhizoma (ZR, 200 ㎍/㎖) and SGT200 (200 ㎍/㎖) SGT400 (400 ㎍/㎖), SGT800 (800 ㎍/㎖) for 1hours, and administrated LPS (Control, 400ng/㎖) for 24 hours. After culture supernatant was analyzed by ELISA kit. All values are mean±SD. †: Significantly different from the non-treated group (†† p<0.01) *: Significantly different from the non-treated group (p<0.05).
- 6) IL-6생성에 미치는 영향
LPS를 처리한 대조군의 IL-6는 40367.43±150.7 pg/㎖로 나타나 정상군의 23.89±96.4 pg/㎖보다 유의하게 증가하였다. 대조군에 비하여 양성대조군인 CsA 투여군에서 17484±979.7, 射干, 桂枝, 生薑 200㎍/㎖ 및 사간탕 200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800㎍/㎖을 투여한 실험군에서 각각 4864.50±728.9 pg/㎖, 24686.20±766.6pg/㎖, 2297.95 ±472.1 pg/㎖, 6511.50±477. 2 pg/㎖, 1697.30±257.0 pg/㎖, 1360.70±653.0 pg/㎖로 유의성 있게 감소하였다( Fig. 8 ).
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Effects of SGT and Individual Herbs on IL-6 Production of LPS Induced RAW264.7 Cells. RAW264.7 cells pretreated with Cyclosporin A (CsA, 10 ㎍/㎖), Belamcandae Rhizoma (BR, 200 ㎍/㎖), Pinellia Tuber (PT, 200 ㎍/㎖), Cinnamomi Ramulus (CR, 200 ㎍/㎖), Zingiberis Rhizoma (ZR, 200 ㎍/㎖) and SGT200 (200 ㎍/㎖) SGT400 (400 ㎍/㎖), SGT800 (800 ㎍/㎖) for 1hours, and administrated LPS (Control, 400ng/㎖) for 24 hours. After culture supernatant was analyzed by ELISA kit. All values are mean±SD. †: Significantly different from the non-treated group (††† p<0.001). *: Significantly different from the LPS-stimulated group (** p<0.01).
- 2. Invivo
- 1) BALF내 neutrophil증가에 미치는 영향
- (1) Cytospin & Neutrophils count
COPD를 유발한 대조군의 neutrophil은 397.00±30.65개로 나타나 정상군의 2.38±0.68개보다 유의하게 증가하였으며, COPD 유발 후 dexamethasone을 처리한 양성대조군은 44.25±2.534, 射干, 半夏, 桂枝, 生薑 및 사간탕을 투여한 실험군은 각각 246.00±44.32, 194.50 ±40.13, 138.50±21.42, 136.50±22.97, 76.00±22.19개로 나타나 모든 실험군에서 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다( Fig. 9 ).
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Effect of SGT and Individual Herbs on (A) Cytospin image and (B) Neutrophils Count of BALF in COPD Mice. Mice were challenged by aspiration of LPS+CSS (Control), and then treated with Dexa (dexamethasone 3 ㎎/㎏), BR (Belamcandae Rhizoma 200 ㎎/㎏), PT (Pinellia Tuber 200 ㎎/㎏), CR (Cinnamomi Ramulus 200 ㎎/㎏), ZR (Zingiberis Rhizoma 200 ㎎/㎏) and SGT (200 ㎎/㎏) for 21 days (n=4). A: Cytospin images of BALF, B: No. of neutrophils. BALF were harvested 24h after the last LPS+CSS challenge. After cytospin, neutrophil number was counted by optical microscope. All values are mean±SD. †: Significantly different from the Normal. († p<0.05) *: Significantly different from the Control (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
- (2) Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
- ① CD4/CD8 gating
COPD를 유발한 대조군의 neutrophil은 CD8의 비율이 정상군의 3.7%에 비해 47.5%로 증가를 보이며, dexamethasone을 투여한 양성대조군에서는 15.7%, 射干, 半夏, 桂枝, 生薑 및 사간탕을 투여한 실험군은 각각 15.9%, 24.7%, 34.3%, 26.5%, 10.2%로 대조군에 비해 감소양상을 보였다 ( Fig. 10-A ).
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Effect of SGT and Individual Herbs on the Percentage of (A) CD4/CD8-gated Cells (B) CD11b/Gr-1-gated Cells in Lung Cells in LPS+CSS-Induced Murine Model of COPD. Mice were challenged by aspiration of LPS+CSS (Control), and then treated with Dexa (dexamethasone 3 ㎎/㎏), BR (Belamcandae Rhizoma 200 ㎎/㎏), PT (Pinellia Tuber 200 ㎎/㎏), CR (Cinnamomi Ramulus 200 ㎎/㎏), ZR (Zingiberis Rhizoma 200 ㎎/㎏) and SGT (200 ㎎/㎏) for 21 days (n=4).
- ② CD11b/Gr-1 gating
COPD를 유발한 대조군의 neutrophil은 정상군의 11.5%에 비해 28.4%로 증가를 보이며, dexamethasone을 투여한 양성대조군에서는 16.3%, 射干, 半夏, 桂枝, 生薑 및 사간탕을 투여한 실험군은 각각 23.1%, 21.8%, 20.3%, 26.4%, 18.2%로 대조군에 비해 감소 양상을 보였다( Fig. 10-B ).
- 2) TNF-α 생성에 미치는 영향
COPD를 유발한 대조군의 TNF- α 는 80.42±2.85 pg/㎖로 나타나 정상군의 0.39±2.00 pg/㎖보다 유의하게 증가하였으며, COPD 유발 후 dexamethasone을 처리한 양성대조군은 11.68±2.59 pg/㎖, 射干, 半夏 및 사간탕을 투여한 실험군에서 각각 11.25±7.98, 17.48±26.27, 8.62±9.23 pg/㎖로 나타나 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다( Fig. 11 ).
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Effect of SGT and Individual Herbs on TNF-α Production of BALF in COPD Mice. The levels of TNF-α in BALF were determined by ELISA. Mice were challenged by aspiration of LPS+CSS (Contol), and then treated with Dexa (dexamethasone 3 ㎎/㎏), BR (Belamcandae Rhizoma 200 ㎎/㎏), PT (Pinellia Tuber 200 ㎎/㎏), CR (Cinnamomi Ramulus 200 ㎎/㎏), ZR (Zingiberis Rhizoma 200 ㎎/㎏) and SGT (200 ㎎/㎏) for 21 days (n=4). All values are mean±SD. †: Significantly different from the Normal (††† p<0.001). *: Significantly different from the Control (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).
- 3) IL-6 생성에 미치는 영향
COPD를 유발한 대조군의 IL-6는 106.76±26.23 pg/㎖로 나타나 정상군의 23.49±3.81 pg/㎖보다 유의하게 증가하였으며, COPD 유발 후 dexamethasone을 처리한 양성대조군은 34.63±18.25 pg/㎖, 사간탕을 투여한 실험군에서 44.03±16.55 pg/㎖로 나타나 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다( Fig. 12 ).
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Effect of SGT and Individual Herbs on IL-6 Production of BALF in COPD Mice. The levels of IL-6 in BALF were determined by ELISA. Mice were challenged by aspiration of LPS+CSS (Contol), and then treated with Dexa (dexamethasone 3 ㎎/㎏), BR (Belamcandae Rhizoma 200 ㎎/㎏), PT (Pinellia Tuber 200 ㎎/㎏), CR (Cinnamomi Ramulus 200 ㎎/㎏), ZR (Zingiberis Rhizoma 200 ㎎/㎏) and SGT (200 ㎎/㎏) for 21 days (n=4). All values are mean±SD. †: Significantly different from the Normal (†† p<0.01). *: Significantly different from the Control (* p<0.05).
- 4) MIP2생성에 미치는 영향
COPD를 유발한 대조군의 MIP2는 99.07±32.38 pg/㎖로 나타나 정상군의 6.50±1.45 pg/㎖보다 유의하게 증가하였으며, COPD 유발 후 dexamethasone을 처리한 양성대조군은 27.72±33.23 pg/㎖, 射干, 半夏 및 사간탕을 투여한 실험군에서 각각 26.83±25.24, 20.89±19.20, 16.06±9.87 pg/㎖로 나타나 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다( Fig. 13 ).
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Effect of SGT and Individual Herbs on MIP2 Production of BALF in COPD Mice. The levels of MIP2 in BALF were determined by ELISA. Mice were challenged by aspiration of LPS+CSS (Contol), and then treated with Dexa (dexamethasone 3 ㎎/㎏), BR (Belamcandae Rhizoma 200 ㎎/㎏), PT (Pinellia Tuber 200 ㎎/㎏), CR (Cinnamomi Ramulus 200 ㎎/㎏), ZR (Zingiberis Rhizoma 200 ㎎/㎏) and SGT (200 ㎎/㎏) for 21 days (n=4). All values are mean±SD. †: Significantly different from the Normal (†† p<0.01). *: Significantly different from the Control (* p<0.05, ** p<0.01).
- 5) CXCL-1생성에 미치는 영향
COPD를 유발한 대조군의 CXCL-1는 1,016.77±41.50 pg/㎖로 나타나 정상군의 151.80±25.60 pg/㎖보다 유의하게 증가하였으며, COPD 유발 후 dexamethasone을 처리한 양성대조군은 414.75±41.45 pg/㎖, 射干, 半夏 및 사간탕을 투여한 실험군에서 각각 268.87±230.49, 313.73±109.37, 158.54±33.88 pg/㎖로 나타나 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다( Fig. 14 ).
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Effect of SGT and Individual Herbs on CXCL-1 Production of BALF in COPD Mice. The levels of CXCL-1 in BALF were determined by ELISA. Mice were challenged by aspiration of LPS+CSS (Contol), and then treated with Dexa (dexamethasone 3 ㎎/㎏), BR (Belamcandae Rhizoma 200 ㎎/㎏), PT (Pinellia Tuber 200 ㎎/㎏), CR (Cinnamomi Ramulus 200 ㎎/㎏), ZR (Zingiberis Rhizoma 200 ㎎/㎏) and SGT (200 ㎎/㎏) for 21 days (n=4). All values are mean±SD. †: Significantly different from the Normal (††† p<0.001). *: Significantly different from the Control (* p<0.05, ** p<0.01).
- 6) 폐조직내 관련 단백질 mRNA 발현에 미치는 영향
COPD를 유발한 대조군의 MUC5AC mRNA RQ는 1.294±0.17로 나타나 정상군의 0.393±0.12보다 증가하였으며, COPD 유발 후 dexamethasone을 처리한 양성대조군은 0.612±0.17, 射干, 半夏 및 사간탕을 투여한 실험군에서 각각 0.563±0.18, 0.819±0.16, 0.641±0.12로 나타나 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다( Fig. 15-A ). COPD를 유발한 정상군의 TGF- β mRNA RQ는 1.117±0.30로 나타나 COPD 유발 후 Dexamethasone을 처리한 양성대조군은 0.472±0.15, 射干 및 사간탕을 투여한 실험군에서 각각 0.670±0.08, 0.361±0.21로 나타나 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다( Fig. 15-B ). COPD를 유발한 대조군의 TNF- α mRNA RQ는 0.833±0.11로 나타나 정상군의 0.671±0.33보다 증가하였으며, COPD 유발 후 dexamethasone을 처리한 양성대조군은 0.432±0.18, 生薑 및 사간탕을 투여한 실험군에서 각각 0.514±0.09, 0.334±0.10로 나타나 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다( Fig 15-C ).
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Effect of SGT and Individual Herbs on (A) muc5AC, (B) TGF-β, and (C) TNF-α mRNA Expression in Lung Tissue in COPD Mice. Muc5AC, TGF-β, TNF-α mRNA expression were measured from lung tissue by RT-PCR. Mice were challenged by aspiration of LPS+CSS (Control), and then treated with Dexa (dexamethasone 3 ㎎/㎏), BR (Belamcandae Rhizoma 200 ㎎/㎏), PT (Pinellia Tuber 200 ㎎/㎏), CR (Cinnamomi Ramulus 200 ㎎/㎏), ZR (Zingiberis Rhizoma 200 ㎎/㎏) and SGT (200 ㎎/㎏) for 21 days (n=4). After RT-PCR, relative quantity (RQ) of control group was estimated. All values are mean±SD. †: Significantly different from the Normal (††† p<0.001). *: Significantly different from the Control (* p<0.05, ** p<0.01).
- 7) 폐조직 손상에 미치는 영향
COPD를 유발한 대조군의 폐조직은 아무것도 처리하지 않은 정상군에서는 작은 크기의 폐포가 균일하게 관찰되었으나, COPD 유발시킨 대조군의 경우 폐포의 형태가 균일하지 않고, 기도벽이 두터워지는 현상이 보이며, 폐포 주변으로 세포가 많이 몰려있는 것을 관찰할 수 있었다. Dexamethasone을 처리한 양성대조군은 폐포의 형태가 균일하게 유지되었으며, COPD 유발 후 射干, 半夏, 桂枝, 生薑 및 사간탕을 투여한 실험군의 경우 폐포 주변에 세포가 몰려있는 현상은 보이지만 대조군에 비해 폐포의 형태가 비교적 균일하게 유지되는 것을 관찰할 수 있었다 ( Fig. 16 ).
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Effect of SGT and Individual Herbs Histophathological Changes of Lung Following LPS+CSS-induced Murine Model of COPD. Mice were challenged by aspiration of LPS+CSS (Control), and then treated with Dexa (dexamethasone 3 ㎎/㎏), BR (Belamcandae Rhizoma 200 ㎎/㎏), PT (Pinellia Tuber 200 ㎎/㎏), CR (Cinnamomi Ramulus 200 ㎎/㎏), ZR (Zingiberis Rhizoma 200 ㎎/㎏) and SGT (200 ㎎/㎏) for 21 days (n=4)
IV. 고 찰
COPD의 병리적 변화는 근위부 중심성 기도, 소기도, 폐실질, 폐혈관 등에 걸쳐 분포하며, 만성적인 염증과 손상에 따른 폐실질의 파괴를 특징으로 한다 23 . COPD환자에 있어 가장 중요한 병태생리는 만성적인 기류제한 24 으로 근위부 기도에서는 폐탄력의 감소로 인해 흉강 내압이 기도 내압보다 높아져 기도폐쇄가 발생하고 25 , 소기도에서는 염증반응에 의해 기도벽이 두꺼워지고 내강이 좁아지며 점액 분비가 증가하여 기도저항이 증가하게 된다 26 . 또한 폐실질에서는 폐기종성 변화가 일어나 폐포벽이 파괴되고, 모세혈관면적이 감소되어 관류가 저하됨으로써 관류에 대한 환기비가 증가되어 진행된 COPD환자에 있어 폐동맥고혈압과 함께 저산소혈증 양상을 보이는 원인이 된다 27,28 .
COPD의 발병기전에 있어 만성적인 염증이 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 흡연이 사람에게서 만성적인 염증을 유발하는 것이 보고된 바 있다 29 . 선천 면역계는 흡연 등 외부의 유해물질이 유입되었을 경우 즉각적인 반응을 보이는데 이로 인해 macrophage의 탐식작용이 활성화되고 CXCL-1, MIP2 등의 chemokine에 의해 화학주성으로 neutrophil이 유도되며 protease 분비가 늘어나 폐실질의 파괴가 일어난다. 유해물질들로 인한 상피세포의 손상은 ligand를 형성하며 Toll-like receptor (TLR)을 통해 인지되어 NF- κ B pathway의 활성에 기여하게 되는데 NF- κ B의 활성화는 macrophage로 하여금 다양한 염증 사이토카인 및 Growth factor발현 mRNA 전사를 촉진시켜 분비를 촉진하게 되며 30 또한 산화스트레스가 NF- κ B 활성을 도와 이러한 염증반응 및 단백손상을 항진시킨다 31 . IL-6, TNF- α 는 염증 사이토카인으로 기도 및 폐실질의 염증반응을 증대시키고 IL-6의 경우 regulatory T cell의 신호를 억제 32 함으로써 COPD의 염증 반응을 더욱 악화시킨다. TGF- β 는 growth factor로 IFN- γ 에 의해 macro phage 혹은 소기도 상피세포에서 발현되며 섬유모세포 혹은 기관지 평활근 세포의 증식을 유발하고 33 mucin 5AC은 MUC5AC gene 유래의 단백질로 COPD 환자에서 기도내 점액생성과다를 유발하여 34 소기도 폐색을 악화시킨다.
본 실험에서 평가된 사간탕 구성약물 각각의 효능을 살펴보면, 射干은 肺經에 귀경하며 性味가 苦寒하여 肺經에 들어가 淸熱解毒, 消痰, 利咽의 효능이 있고, 半夏는 脾․胃․肺經에 귀경하며 性이 溫燥하여 燥濕化痰, 消痞散結시키는 主藥이 된다. 桂枝는 心,․肺․膀胱經에 귀경하며 性이 溫하므로 助陽化氣하여 痰飮과 蓄水의 證을 치료하고, 生薑은 肺․脾․胃經에 귀경하며 性味가 微溫辛하여 溫肺止咳하고 咳嗽痰多를 치료하여 35 , 사간탕은 止咳, 祛痰을 통한 喘症의 해소를 목적으로 한 처방이다 20 .
기존의 폐 손상 동물모델에 대한 한약의 효과 연구로 LPS 13,16,18,19 elastase 11,12 , 담배연기 흡입 17,36,37 등 여러 가지 방법이 시도되었으나, 본 실험에선 이 등 10 및 Mizutani 등 21 의 연구와 같이 BALB/c mouse에 LPS와 CSS를 기도내 흡인시켜 COPD를 유발시켰으며 COPD의 가장 중요한 위험인자인 흡연7을 고려하였다.
RAW264.7 세포를 이용한 세포독성 시험에서 사간탕과 구성 약물 각각을 10 ㎍/㎖에서 500 ㎍/㎖ 농도범위로 처리한 결과, 半夏 추출물 300 ㎍/㎖를 24시간 처리하였을 때를 제외하고 아무것도 처리하지 않은 정상군에 비해 80-100%의 생존율 범위를 유지하여 세포독성을 나타내지 않았다. 24시간 처리 半夏 추출물 300 ㎍/㎖ 투여군의 생존율이 79.28%로 나타나 80%에 거의 근접한 수준이었으나 500 ㎍/㎖ 투여군의 84.99%보다 낮았다는 점에서 추가적인 연구가 더 필요할 것으로 생각된다( Fig. 3 ).
RAW264.7 세포를 이용한 ELISA 분석에서 LPS를 처리한 대조군의 NO는 유의하게 증가하였고, 대조군에 비하여 射干, 生薑의 모든 농도 및 半夏 500 ㎍/㎖에서 유의하게 감소하였고, 30 ㎍/㎖을 제외한 桂枝의 모든 농도에서 유의성 있게 감소하였으며, 30 ㎍/㎖ 이상의 사간탕 실험군에서 유의하게 감소시켰다 ( Fig. 4 ). 유세포분석에서 LPS를 처리한 대조군의 세포는 높은 형광강도에서 세포수 peak를 형성하였고, LPS에 사간탕 및 射干, 半夏, 桂枝, 生薑 (100 ㎍/㎖)을 처리한 실험군은 대조군보다 낮은 형광강도에서 세포수의 peak를 형성시켜 잔존 ROS를 감소시키는 양상을 보였다 ( Fig. 5 ). 이러한 산화물질 분석결과는 흡연자의 폐포 대식세포가 세포질 내외로 산화물질을 유리하여 산화스트레스를 증가시킨다는 연구 23 결과를 참고할 때, 사간탕이 산화스트레스로 인한 폐조직의 손상에 대한 복구장애로 폐기종이 발생하는 병리적 변화 24,25 를 감소시키는 작용을 나타낼 가능성을 보여준다고 사료된다.
RAW264.7 세포를 이용한 Western blot 분석에서 LPS를 처리한 대조군 NF- κ B의 YY-1에 대한 상대 밀도는 정상군보다 증가하였고, 대조군에 비하여 및 射干, 半夏, 桂枝, 生薑 및 사간탕 100 ㎍/㎖을 투여한 실험군에서 감소하는 경향을 보였다 ( Fig. 6 ). 또한 ELISA 분석에서 LPS를 처리한 대조군의 TNF- α , IL-6는 정상군보다 유의하게 증가하였으나, 대조군에 비하여 射干, 生薑 200㎍/㎖, 사간탕 200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800㎍/㎖을 투여한 실험군에서 TNF- α 를 유의성 있게 감소시켰고, 射干, 桂枝, 生薑 200㎍/㎖, 사간탕 200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800㎍/㎖을 투여한 실험군에서 IL-6를 유의성 있게 감소시켰다 ( Fig. 7 , Fig. 8 ). 이상의 결과로 볼 때 사간탕과 사간탕 구성약물이 NF- κ B pathway의 활성으로 산화물질이 증가하고 macrophage에서 염증 cytokine 발생이 증가하는 전 과정에 억제효과를 나타냄으로써 NF- κ B pathway에 대한 조절작용을 보이는 것으로 생각된다.
COPD유발 마우스 모델 BALF의 원심분리 후 현미경적 관찰에서 대조군의 neutrophil은 정상군보다 유의하게 증가하였으며, COPD 유발 후 射干, 半夏, 桂枝, 生薑 및 사간탕을 투여한 실험군에서 모두 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다( Fig. 9 ). 대조군의 neutrophil 증가는 기존의 실험들 10,15-18 과도 일치하는 결과로 실제 흡연자 및 COPD의 환자에서 활성화된 neutrophil이 증가한다는 보고가 있으며 26 증가된 neutrophil이 COPD환자에 있어 기류제한 27 및 폐기능 감소속도 28 에도 연관이 있고, 만성염증의 병리기전에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. BALF의 FACS 분석에서 또한 neutrophil을 감소시키는 경향을 보였는데 대조군의 neutrophil은 정상군에 비해 증가를 보였고, 양성대조군 및 모든 실험군에서 모두 대조군에 비해 감소양상을 보였다. FACS분석에서 anti-CD11b-FITC, anti-Gr-1-PE는 granulocyte 표면 단백질 항원에 대한 형광염색항체로 본 실험에서는 granulocyte를 neutrophil로 간주하여 그 공통분모를 확인하였다.
COPD유발 마우스 모델 BALF의 FACS 분석에서 대조군의 neutrophil은 CD8+의 비율이 정상군에 비해 확연한 증가를 보였으며, dexamethasone을 투여한 양성대조군 및 射干, 半夏, 桂枝, 生薑 및 사간탕을 투여한 실험군에서 모두 대조군에 비해 감소양상을 보였다 ( Fig. 10 ). CD8+ T세포의 경우 폐실질에 널리 분포하여 그 비율이 증가할수록 상피세포의 세포자멸을 유도하여 29 폐조직 손상에 중요한 인자로 이해되고 있으며 30 COPD환자의 폐조직에서 CD8+ T세포가 증가되어 있다고 보고되고 있다 31 . 다만 CD4+의 비율이 射干 및 사간탕 투여군에서 대조군에 비해 증가하는 양상을 보이는데 이는 CD8 비율 감소폭에 따른 상대적인 증가로 판단된다.
COPD유발 마우스 모델 BALF의 ELISA 분석에서 대조군의 TNF- α 는 정상군보다 유의하게 증가하였으며, 射干, 半夏 및 사간탕을 투여한 실험군에서 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다( Fig. 11 ). 또한 IL-6는 대조군에서 정상군보다 유의하게 증가하였으며, 사간탕을 투여한 실험군에서 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다 ( Fig. 12 ). COPD환자는 객담에서 TNF- α 32 , IL-6 33 등 염증 cytokine의 증가를 보이는데, 사간탕과 사간탕 구성약물들이 이들 염증 cytokine들을 감소시키는 결과로 볼 때 macrophage 및 neutrophil 매개의 염증에 억제효과를 보이는 것으로 판단된다.
COPD유발 마우스 모델 BALF의 ELISA 분석에서 대조군의 MIP2, CXCL-1은 정상군보다 유의하게 증가하였으며, 射干, 半夏 및 사간탕을 투여한 실험군에서 대조군에 비하여 유의하게 감소하였고 射干, 半夏 단미 투여군보다 사간탕 투여군에서 더 유의성 있는 감소효과를 보였다( Fig 13 , Fig 14 ). 실제로 CXCL-1의 경우 COPD 환자의 객담에서 증가한다는 보고가 있고 34 MIP2, CXCL-1은 chemokine으로서 macrophage로부터 발현되며 neutrophil 등 염증관련 세포들을 모집하는 역할을 하는 것으로 알려져 있어 35 사간탕이 이들 chemokine의 발현을 감소시킴으로써 염증관련 세포의 기도내 유입 억제에 대한 가능성을 확인하였다.
COPD유발 마우스 모델 폐조직의 real-time PCR 분석에서 MUC5AC mRNA RQ는 정상군보다 유의하게 증가하였으며, 射干, 半夏 및 사간탕을 투여한 실험군에서 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다. TGF- β mRNA RQ는 射干 및 사간탕을 투여한 실험군에서 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다. TNF- α mRNA RQ는 정상군보다 유의하게 증가하였으며, 生薑 및 사간탕을 투여한 실험군에서 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다 ( Fig. 15 ). MUC5AC는 TNF- α 에 의해 발현이 유도되어 mucin 분비를 늘리고 인체 기도의 상피세포에 작용하는데 36,37 사간탕 투여가 MUC5AC, TNF- α mRNA 발현을 억제함으로써 상피세포에서의 점액 분비를 줄이고 TGF- β mRNA 발현을 억제함으로써 기도벽의 비후를 감소시켜 소기도 폐색에 또한 효과를 보일 것으로 유추할 수 있다.
COPD유발 마우스 모델 폐조직 생검 및 현미경적 관찰에서 대조군 조직은 결합조직이 collagen으로 대치되어 있고 폐포주변의 염증세포가 다수 관찰되며 폐포의 형태가 불규칙한데 반해 모든 실험군에서 대조군보다 염증세포가 감소되어 있으며 폐포가 비교적 균일하게 유지되어 염증반응을 줄임으로써 사간탕 및 각 구성약물의 폐조직 손상에 대한 보호효과를 확인하였고, 여타 실험군보다 사간탕 복합제 투여군에서 더 균일한 폐포 형태를 확인할 수 있었다( Fig. 16 ).
In vitro 실험에서는 사간탕이 세포독성이 없으며 NF- κ B발현을 줄이고 산화물질을 감소시키며 macrophage에서 TNF- α , IL-6 발생을 줄이는 효과가 있다는 것을 관찰할 수 있었고, in vivo 실험에서는 사간탕이 COPD 동물모델에서 BALF내 neutrophil을 감소시키고 CD8 비율을 줄이며 관련 단백질 및 단백질 관련 mRNA 발현에도 영향을 미치며 폐조직 손상에 대한 보호효과도 있음을 확인할 수 있었다. 또한 복합제로서의 사간탕과 사간탕 구성약물들에서의 결과 비교를 통해, 개별 약물들은 복합제로서의 사간탕에 비해 한정적인 부문에서 효과를 보이며 일부 약물에만 그 효과가 치우쳐져 있는 것을 관찰할 수 있었다.
COPD의 발병기전에 있어 만성적인 염증이 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 흡연이 사람에게서 만성적인 염증을 유발하는 것이 보고된 바 있다 38 . 선천 면역계는 흡연 등 외부의 유해물질이 유입되었을 경우 즉각적인 반응을 보이는데 이로 인해 macrophage의 탐식작용이 활성화되고 CXCL-1, MIP2 등의 chemokine에 의해 화학주성으로 neutrophil이 유도되며 protease 분비가 늘어나 폐실질의 파괴가 일어난다. 유해물질들로 인한 상피세포의 손상은 ligand를 형성하며 Toll-like receptor (TLR)을 통해 인지되어 NF- κ B pathway의 활성에 기여하게 되는데 NF- κ B의 활성화는 macrophage로 하여금 다양한 염증 사이토카인 및 Growth factor발현 mRNA 전사를 촉진시켜 분비를 촉진하게 되며 39 또한 산화스트레스가 NF- κ B 활성을 도와 이러한 염증반응 및 단백손상을 항진시킨다 40 . IL-6, TNF- α 는 염증 사이토카인으로 기도 및 폐실질의 염증반응을 증대시키고 IL-6의 경우 regulatory T cell의 신호를 억제 41 함으로써 COPD의 염증 반응을 더욱 악화시킨다. TGF- β 는 growth factor로 IFN- γ 에 의해 macrophage 혹은 소기도 상피세포에서 발현되며 섬유모세포 혹은 기관지 평활근 세포의 증식을 유발하고 42 mucin 5AC은 MUC5AC gene 유래의 단백질로 COPD환자에서 기도내 점액생성과다를 유발하여 43 소기도 폐색을 악화시켜 증상 악화의 결정적인 요인이라 할 수 있다.
결과를 종합하면 사간탕은 각각의 구성약물 단미제보다 복합제 투여의 장점이 크고, neutrophil 및 염증 cytokine이 증가하는 과정에 있어 억제효과를 보이며 결합조직의 손상을 방지하는 폐 손상 보호효과를 통하여 COPD에 대한 치료효과를 나타낼 것으로 사료된다.
V. 결 론
사간탕의 COPD에 대한 효능을 평가하기 위하여 RAW264.7 세포에서의 항염증 효과와 LPS와 표준담배 추출물로 유도한 COPD 생쥐 모델에서 관련 면역세포와 cytokine 및 폐 손상에 연관된 단백질의 변화를 연구한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
In vitro
1. 사간탕은 10-500 ㎍/㎖ 농도에서 정상군에 비해 80-100%의 생존율 범위를 유지하여 세포독성을 나타내지 않았다.
2. 사간탕은 30 ㎍/㎖이상의 실험군에서 NO의 증가를 유의하게 감소시켰다.
3. 사간탕은 100 ㎍/㎖ 실험군에서 ROS를 감소시키는 경향을 보였다.
4. 사간탕은 100 ㎍/㎖ 실험군에서 NF- κ B 발현을 감소시키는 경향을 보였다.
5. 사간탕은 200 ㎍/㎖ 이상 농도의 실험군에서 TNF- α , IL-6의 증가를 유의하게 감소시켰다.
In vivo
1. 사간탕은 200 ㎎/㎏ 투여군에서 BALF 내 neutrophil수의 증가를 유의하게 억제하였다.
2. 사간탕은 200 ㎎/㎏ 투여군에서 BALF 내 TNF- α , IL-6의 증가를 유의하게 감소시켰다.
3. 사간탕은 200 ㎎/㎏ 투여군에서 BALF 내 MIP2, CXCL-1의 증가를 유의하게 감소시켰다.
4. 사간탕은 200 ㎎/㎏ 투여군에서 폐조직의 muc5AC, TGF- β , TNF- α mRNA 발현 증가를 유의하게 감소시켰다.
5. 사간탕은 200 ㎎/㎏ 투여군에서 폐의 조직학적 손상을 감소시켰다.
이상의 결과로 사간탕은 세포독성이 없으며, RAW 264.7 cell line 및 COPD 유발 동물모델에서 염증 cytokine 및 면역세포를 조절하고 폐 손상을 억제시킴으로써 COPD에 효과가 있음을 확인했다.
Acknowledgements
본 연구는 2015년도 정부 (교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원 (과제번호: NRF-2015R1D1A1A01058852)을 받아 수행되었음.
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