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Anti-oxidative and anti-inflammatory experiments of Talmyung-san in RAW264.7 cells
Anti-oxidative and anti-inflammatory experiments of Talmyung-san in RAW264.7 cells
Herbal Formula Science. 2014. Jun, 22(1): 79-92
Copyright © 2014, The Korean Academy of Oriental Medicine prescription
This paper is available at http//:www.ompak.okdanche.com which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
  • Received : May 05, 2014
  • Accepted : June 10, 2014
  • Published : June 30, 2014
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현진 조
선동 박
sundong@dongguk.ac.kr

Abstract
Objectives :
The aim of this study was identification of the anti-oxidative and anti-inflammatory effects of Talmyung-san (TMS) in mouse macrophage, RAW264.7 cells.
Methods :
To identify the anti-oxidative effect of TMS, scavenging activities of DPPH radical, nitric oxide and peroxynitrite were measured in vitro . In RAW264.7 cells, DCFH-DA assay was conducted to examine the inhibitory effect of TMS on ROS production in response to lipopolysaccharide. And the productions of nitric oxide (NO), PGE 2 and pro-inflammatory cytokines were measured. The levels of COX-2, iNOS, nuclear NF-κB p65 expression and phosphorylation of IκB-α in cytosol were detected by western blotting analyses.
Results :
TMS couldn’t scavenged DPPH radical, but nitric oxide and peroxynitrite were decreased. TMS decreased intracellular ROS, NO, and IL-1β production effectively. However, TMS inhibited PGE 2 levels only in high concentration (300 ㎍/㎖) and TMS failed to suppress the production of IL-6 and TNF-α. Results from immunoblot analyses revealed that TMS decreased activation of COX-2, iNOS, phosphorylation of IκB-α and nuclear translocation of p65.
Conclusions :
TMS has anti-RNS and anti-inflammatory effects via NF-κB pathway and more intensive studies will be required to evaluate therapeutic potential of TMS.
Keywords
Ⅰ. 서 론
탈명산 (奪命散, Talmyung-san, TMS)은『東醫寶鑑·風門』에 수록되어 있는 처방으로, 원 출전은 龔廷賢의『古今醫鑑』이다.『東醫寶鑑』에는 “졸중풍으로 침을 흘리고, 氣가 막히며, 이를 악물고 눈을 곧추 보는 것과 파상풍으로 경련이 이는 것, 어린이의 驚風 등 위급한 병을 치료한다” 1) 라고 기록되어 있다. 본 처방은 천남성, 정력자, 백지, 반하, 파두, 생강즙으로 구성되어 있다. 박 2) 등은 탈명산이 培養心筋細胞 및 血管平滑筋細胞에 미치는 영향에 관하여 연구하면서 출전을 『醫宗金鑑』 3) 으로 언급한 바 있는데, 여기서의 주치증도 졸중풍이라는 면에서『東醫寶鑑』에 수록된 바와 비슷하며, 본초의 구성도 동일하다. 다만 奪命散이라는 처방명의 한자명이 위급한 상황을 구명한다는 의미가 좋아서인지 역대 醫家에 의해 다양한 구성의 처방들에 사용된 바 있으므로 연구 및 임상 활용시 同名異方이 아닌지 유의할 필요가 있다.
탈명산의 구성 본초 중 정력자는 항암과 항염 증 효과 4)5) 가 연구된 바 있으며, 백지는 기도의 알러지 염증 억제를 통한 천식 억제 효과 6) , 구성성분의 항암효과 7) , 항균 및 항염증 효과 8) , 반하는 기도 염증 억제효과 9)10) , 항종양효과 11) , 다낭성 난소증후군에서 낭성 난포 형성, 난소 무게에 효과 12) 가 있다는 등의 다양한 효과가 증명된 바 있고, 파두는 근육이완 및 통증완화 13) , 위장관 장애에 대한 효과 14)15) 등이 보고되었다.
하지만 위의 본초들이 조합된 탈명산에 관하여 국내외에서 수행된 연구는 앞서 언급한 박 등 2) 이 수행한 연구가 유일하며, 그 항산화 및 항염증 효과에 관한 증명은 부족한 실정이다.
졸중풍은 대표적인 심혈관계 질환 중의 하나로서, 한의학 임상에서 중요한 치료대상으로 취급되어 왔으며, 이를 치료하는 약물에 대한 검증도 꾸준히 진행되어 왔다. 중풍은 그 발생 및 진행과정에서 염증반응과 중요한 관계가 있다는 점이 증명된 바 있으며 16)17) , 중풍 치료약물은 염증을 치료하는 효과를 겸비할 필요성이 있다. 따라서 탈명산의 중풍 치료효과를 증명하는데 있어 항염증효과를 규명할 필요성이 있다고 사료되며 기존의 연구가 이를 증명하는 데 부족한 점이 있었으므로 추가적인 연구를 수행하였다.
탈명산의 항산화 및 항염증 효과를 규명하기 위하여 본 처방을 메탄올로 추출하여 그 추출물로 in vitro 상에서 항산화 효과를 규명하기 위한 각종 실험을 수행하였고, 마우스의 대식세포인 RAW264.7 세포를 이용하여 항염증 효과를 검증하였다. 이러한 일련의 실험을 통해 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
Ⅱ. 재료 및 방법
- 1. 재료
- 1) 약재
본 실험에 사용한 탈명산의 구성 한약재들은 (주) 휴먼허브 (경북, 경산)에서 구입하여 저자의 연구기관에서 정선하여 사용하였다. 탈명산의 구성 한약재와 그 용량은 Table 1 에 표기하였다. 총 600 g의 탈명산에 100% methanol 4000 ㎖를 가하여 3일간 실온에서 추출하였으며, 이를 총 2회 실시하였다. 이 수득물을 wattman paper로 여과 후 동결 건조하여 39.22 g의 메탄올 추출물(수율 6.54%)을 얻었다. 이후 각종 실험을 위해서 분말화된 추출물을 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해한 후 0.20 ㎛ filter로 여과하여 사용하였다 ( Fig. 1 ).
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Extraction Procedures of TMS
- 2) 시약
실험에 사용된 시약 중 DMSO는 Amresco (Solon, USA)에서, methanol은 Samchun Chemicals (Pyungtack city, Republic of Korea)에서 구입하였다.
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 4,5-diaminofluorecein (DAF-2), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), 6-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA), 4-(2-aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride (AEBSF), lipopolysaccharide (LPS), CAPS, tween 20, sodium phosphate, sodium chloride, potassium chloride, sodium nitroprusside (SNP)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)에서 구입하였다.
Dihydrorhodamine 123 (DHR 123)은 Molecular Probes (Eugene, USA)에서, peroxynitrite는 Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, USA)에서 구입하였다.
세포 배양액인 dulbecco's modified eagle medium(DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillinstreptomycin등의 세포배양용 시약들은 Gibco BRL사 (Grand Island, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 inducible nitric oxide synthase (iNOS)antibody, anti-rabbit IgG horseradish peroxidase(HRP)-conjugated antibody와 anti-mouse IgG HRPconjugated antibody는 Santa Cruz Biotechnology사 (Santa Cruz, USA)에서, cyclooxygenase-2(COX-2), phospho inhibitory kappa B alpha (p-IκBα), nuclear factor kappa B (NF-κB) p65, poly ADP-ribose polymerase (PARP)와 β-actin antibody는 Cell Signaling Technology사 (Beverly, USA)에서 구입하였다.
Nuclear and cytoplasmic protein extraction reagents와 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kits for tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin IL)-1β, enhanced chemiluminescence detection kit는 Thermo Scientific (Rockford, USA)에서 구매하였다.
Sodium dodesyl sulfate (SDS), acrylamide, bis-N,N'-acrylamide, protein assay reagent는 Bio-Rad (Hercules, USA)에서, tris base와 The CellTiter 96Ⓡ aqueous one solution cell proliferation assay (MTS) kit, griess reagent system는 Promega (Madison, USA)에서, prostaglandin E 2 (PGE 2 ) immunoassay kit는 R&D Systems (Minneapolis, USA)에서, immunosorbent assay (ELISA) kit for IL-6는 BD Biosciences (San Diego, USA)에서 구매하였다.
실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급 이상으로 사용하였다.
- 2. 방법
- 1) Free radical 소거활성 측정
- (1) DPPH radical 소거활성 측정
DPPH radical에 대한 소거활성은 Gyamfi 등의 방법 18) 에 따라 측정하였다. 먼저 탈명산 시료 50 ㎕에 0.1 mM DPPH 용액 1 ㎖과 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) 450 ㎕를 가하고 충분한 vortex를 수행하여 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 30분간 incubation한 다음, microplate reader (VersaMax, Molecular Devices, USA)로 파장 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- (2) Nitric oxide 소거활성 측정
Nitric oxide (NO)의 소거활성은 Nagata 등의 방법 19) 에 의하여 측정하였다. 먼저 1 mg의 DAF-2를 0.55㎖의 DMSO에 용해시키고, 이를 다시 50mM phosphate buffer를 사용하여 400배 (v/v)로 희석해서 DAF-2 용액을 준비해 놓았다. 시료 10㎕를 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) 130 ㎕와 혼합한 다음, 40 mM SNP 10 ㎕ 및 DAF-2 용액 50 ㎕를 첨가하였다. 반응용액을 실온에서 10분간 배양한 다음, DAF-2와 NO의 반응에 의해 생성되는 triazolofluorescein의 형광강도를 fluorescence microplate reader (SPECTRA MAX GEMINI EM, Molecular Devices Corp., USA)를 사용하여, excitation 파장 495 nm 및 emission 파장 515nm에서 측정하였다.
- (3) Peroxynitrite 소거활성 측정
탈명산의 peroxynitrite 소거활성은 Kooy 등의 방법 20) 에 의하여 측정하였다. 시료 10 ㎕를 4 ㎕의 5 mM DTPA와 0.2 ㎕의 5 mM DHR 123을 포함하고 있는 rhodamine buffer (50 mM sodium phosphate dibasic, 50 mM sodium phosphate monobasic, 90 mM sodium chloride and 5 mM potassium chloride)와 섞어준다. 반응은 10 μM peroxynitrite를 10 #x3395; 넣으면서 시작되는데, 실온에서 10분간 배양한 다음, DHR 123과 peroxynitrite 의 반응에 의해 생성되는 형광강도를 fluorescence microplate reader를 사용하여, excitation 파장 480nm 및 emission 파장 530 nm에서 측정하였다.
모든 free radical 소거활성은 세 번 실험하여 통계 처리를 거친 평균값으로 표기하였으며, 소거활성은 50%의 소거능을 보이는 농도 (IC 50 )로 표시하였다.
- 2) 세포배양
마우스의 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO 2 조건에서 배양하였다.
- 3) Cell viability 측정
탈명산 메탄올 추출물의 세포에 대한 독성 측정은 MTS assay 방법 21) 으로 분석하였다. 96 well plate에 1×10 4 cells/well의 RAW264.7 세포를 분주하고 시료를 농도별 (10-1000 ㎍/㎖)로 18시간동안 처리하였다. 그 이후 하나의 well당 20 ㎕의 MTS solution을 첨가하여 37℃, 5% CO 2 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader (DYNEX, Opsys MR, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다. 각 농도별 약제가 갖는 흡광도는 세포를 뺀 배지를 같이 배양하여 대조군과 실험군의 흡광도를 비교해서 보정하였다.
- 4) DCFH-DA assay
탈명산의 메탄올 추출물이 LPS에 의한 RAW264.7세포의 산화적 손상을 보호하는 효과를 측정하기 위하여 DCFH-DA assay를 실시하였다. 22) 먼저 세포를 96 well plate에 1×10 4 cells/well로 분주하고, 탈명산을 농도별로 1시간 전처리한 후 100ng/㎖의 LPS를 처리하여 37℃, 5% CO 2 의 조건에서 18시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 10 μM DCFH-DA를 처리하여 45분간 다시 배양하였다. Phosphate buffered saline (PBS)로 2회 세척하고 fluorescence microplate reader를 사용하여 excitation 파장 485 nm와 emission파장 535 nm에서 형광강도를 측정하였다.
- 5) NO 생성량 측정
NO의 생성량을 측정하기 위해서 배양액 내의 nitrite 농도를 griess reagent를 23) 이용하여 측정하였다. RAW264.7 세포에 탈명산 추출물을 농도별로 전처리하고 1시간 후 100 ng/㎖의 LPS를 처리하여 18시간 배양하였다. 배양액 50 ㎕와 같은 양의 griess reagent를 넣어주고 10분간 상온에서 반응 시킨 후 microplate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액 내의 NO 농도를 계산하였다.
- 6) PGE2 생성량 측정
세포 배양액 내의 PGE 2 양을 측정하기 위해 kit로 실험을 실시하였다. 세포에 탈명산 추출물을 농도별로 전처리하고 이후 100 ng/㎖의 LPS를 처리하였다. 18시간 후 세포 배양액을 얻어 PGE 2 측정에 사용하였다. 실험방법은 제조사의 매뉴얼에 따랐다.
- 7) 세포 배양액 내의 cytokine 측정
세포 배양액 내의 IL-1β, IL-6, TNF-α의 양은 ELISA를 이용하여 각 제조사의 매뉴얼에 따라 측정하였다. RAW264.7 세포에 탈명산 추출물을 1시간 동안 전처리한 후, 100 ng/㎖의 LPS를 처리하여 18시간 후 세포 배양액을 얻어 cytokine측정에 이용하였다.
- 8) Western blot analysis
전기영동을 위한 단백질 시료의 추출을 위해 세포를 PBS로 3회 세척한 후, lysis buffer (pH7.5, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM sodium orthovanadate, 10 ㎍/㎖ aprotinin, 10 ㎍/㎖ leupeptin 및 1 mM PMSF)를 넣어 4℃에서 30분간 반응시키고 12,000×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 모았다. Cytosol과 nuclear extract의 경우는 nuclear extraction kit를 사용하여 얻었다.
단백질, cytosol, nuclear extract를 얻은 이후, 각 시료의 단백질 함량은 Bradford protein assay kit를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.
동량의 단백질 시료를 sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리시킨 후, 단백질을 nitrocellulose membrane 에 transfer하였다. Membrane을 blocking buffer(5% non-fat milk와 0.1% tween 20을 함유한 TBS 용액)에서 1시간 동안 반응시킨 후, 단백질에 대한 항체를 가하여 2시간 동안 반응시켰다. 0.1% Tween 20을 함유한 TBS-T 용액으로 40분간 세척한 다음, secondary antibody로 반응시켰다. 이어서 ECL system으로 반응 시킨 후 X-ray film상에서 단백질을 확인하였다.
- 3. 통계처리
결과는 means±SEM으로 나타내었으며, 통계분석법은 GraphPad Prism 4.0을 이용하여 one-way ANOVA로 분석하여 duncan's multiple range tests로 사후검정하여 P값이 0.05 미만일 때 유의한것으로 판정하였다.
Ⅲ. 실험결과
- 1. Free radical 소거능
탈명산의 항산화 효과를 실험하기 위하여, 각종 free radical을 소거하는 in vitro 실험을 실시하였다.
먼저, DPPH radical에 대한 소거활성을 측정한 결과, 탈명산은 DPPH radical을 소거하는 능력이 사실상 없었다. 탈명산을 농도를 올려 처리한 상태에서도 소거능이 유의하게 나타나지 않아 IC 50 값도 계산할 수 없었다 ( Fig. 2A ).
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Scavenging activities of TMS extract on free radicals. A) Scavenging activity on DPPH radical.B) Scavenging activity on nitric oxide.C) Scavenging activity on peroxynitrite.Significantly different from control (*); ***: P<0.001
하지만 nitric oxide와 peroxynitrite의 경우 농도 의존적으로 소거하는 효과를 나타냈다. Nitric oxide의 경우 탈명산을 4.55 ± 0.33 ㎍/㎖ 처리하였을 때 50%가 소거되었으며, peroxynitrite의 경우 25.92 ± 2.71 ㎍/㎖에서 50%가 소거되는 결과를 나타냈다 ( Fig. 2B , Fig.). 이 결과는 탈명산의 항산화 효과가 reactive nitrogen species (RNS)를 소거하는 능력에 의존하고 있음을 추측가능하게 한다.
- 2. 탈명산이 RAW264.7 세포에서 세포 생존률에 미치는 영향
마우스 대식세포인 RAW264.7에 대한 탈명산의 세포독성을 알아보기 위하여 MTS assay를 수행하였다. 탈명산의 메탄올 추출물을 10-1000㎍/㎖ 의 농도로 처리하여 18시간이 지난 이후 세포생존률을 측정한 결과, 300 ㎍/㎖의 농도까지 90% 이상의 생존률을 나타내었으며, 그 이상의 농도에서 세포 생존률이 급감하는 결과가 나타났다 ( Fig. 3 ). 따라서 추후 실험은 300 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 실시하였다.
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Effect of TMS extract on the RAW264.7 cells viability. RAW264.7 cells were treated with various concentrations of TMS extract for 18 hrs. Cell viability was measured by MTS assay. Data were chosen from three independent triplicate experiments.
- 3. RAW264.7 세포에서 LPS로 유도한 활성산소 생성에 미치는 영향
세포 단위에서 생성되는 활성 산소에 탈명산이 미치는 영향을 관찰하기 위하여 DCFH-DA assay를 실시하였다. 본 실험에서 양성대조군으로 AEBSF 0.3 mM을 사용하였다.
Fig. 4 에서 볼 수 있는 바대로, 50-300 ㎍/㎖의 탈명산은 100 ng/㎖의 LPS에 의해 증가한 활성산소를 통계적으로 유의하게 감소시켰으며, 50 ㎍/㎖의 처리만으로도 고농도로 처리 하였을 때와 유사한 감소량을 나타냈다.
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Inhibitory effect of TMS on ROS production in RAW264.7 cells induced by LPS. RAW264.7 cells were preincubated with 50-300 ㎍/㎖ of TMS for 1 hrs, and then further treated with 100 ng/㎖ LPS for 18 hrs to induce ROS production. The increase of DCF fluorescence was calculated as increasing fold of control. Significantly different from control (#) or LPS alone (*); ###, ***: P < 0.001.
- 4. RAW264.7 세포에서 NO와 PGE2의 생성량에 탈명산이 미치는 영향
RAW264.7 세포에서 LPS 자극에 의해 증가하는 nitric oxide의 생성에 탈명산의 효과를 관찰하기 위하여 griess reagent system을 사용하여 실험을 실시하였다. 양성 대조군으로 AEBSF 0.3 mM을 사용하였다. 그 결과, 탈명산의 처리량을 늘림에 따라 농도 의존적으로 NO의 생성량이 감소하는 결과를 관찰 할 수 있었다 ( Fig. 5A ). IC 50 값은 69.74±0.07 ㎍/㎖이었다.
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Effect of TMS on LPS-induced NO and PGE2 production. RAW264.7 cells were treated with LPS and TMS as described in Figure 4. The NO and PGE2 production in the culture medium was measured by griess reagent and ELISA kit, respectively. Significantly different from control (#) or LPS alone (*) ; ###, *** : P < 0.001, * : P < 0.05.
LPS로 유도되는 PGE 2 의 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, Fig. 5B 에 표기한 바대로 50, 100 ㎍/㎖을 처리하였을 때는 각각 10.07±0.46%, 17.75±0.46% 감소하여 PGE 2 의 감소량이 적었으나, 300 ㎍/㎖ 처리시에는 62.92±1.88%로 PGE 2 를 통계적으로 유효하게 감소시켰다. IC 50 값은 242.29±6.71 ㎍/㎖ 이었다.
- 5. LPS로 유도된 염증성 cytokine의 생성량에 미치는 영향
염증성 사이토카인 (proinflammatory cytokines) 은 염증을 나타내는 중요한 지표이므로, RAW264.7세포에서 LPS에 의해 증가하는 염증성 사이토카인에 대한 탈명산효능을 관찰하였다. RAW264.7세포에 탈명산 추출액 50, 100 #x338D;/㎖을 1시간 동안 전 처리한 후 100 ng/㎖의 LPS를 18시간 동안 처리하여 LPS에 의해 유도되는 cytokine의 생성량을 조사하였다.
Fig. 6A 에서 살펴볼 수 있는 것처럼, 탈명산은 IL-1β를 농도 의존적이며 통계적으로 유의하게 감소시켰으며 50 ㎍/㎖를 처리했을 때 74.35±0.19%감소하였고, 100 ㎍/㎖ 처리시에는 88.61±0.29%감소하였다.
반면, 탈명산은 IL-6의 생성을 억제하지 못하였고 ( Fig. 6B ), TNF-α의 생성은 100 ㎍/㎖의 탈명산 처치 농도에서 6.39±0.83%의 감소량을 나타내었으며, 비록 통계적으로 유의한 감소량을 얻을수 있었지만 그 효과가 미미함을 알 수 있었다( Fig. 6C ).
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Inhibition of LPS-induced TNF-α, IL-1β and IL-6 by TMS. RAW264.7 cells were preincubated with 50 or 100 ㎍/㎖ of TMS for 1 hr and then treated with 100 ng/㎖ LPS for 18 hrs. The IL-1β, IL-6 and TNF-α productions were measured by ELISA. Significantly different from control (#) or LPS alone (*); ###, *** : P < 0.001.
- 6. RAW264.7 세포에서 COX-2와 iNOS의 발현에 미치는 영향
COX-2는 PGE 2 의 생성에, iNOS는 NO의 생성에 관여하여 염증반응에 영향을 끼친다. 탈명산의 항염증 작용을 규명하기 위해, RAW264.7 세포에서 LPS로 유도된 COX-2와 iNOS의 발현에 탈명산 메탄올 추출물이 미치는 영향을 western blot분석을 통해 조사하였다. LPS 단독 처리시 COX-2와 iNOS의 발현이 유의하게 증가하였으며, 탈명산 50, 100 ㎍/㎖을 처리한 lane에서 LPS로 증가한 COX-2와 iNOS의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다.
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Inhibition of LPS-induced COX-2 and iNOS expression by TMS. COX-2 or iNOS protein was immunoblotted in whole cell lysates which had been treated with TMS and LPS as described in the legend of Figure 6.. Equal protein loading was verified by β-actin immunoblotting.
- 7. RAW264.7 세포에서 NF-κB의 활성에 미치는 영향
대식세포에서 LPS로 유도되는 NF-κB의 핵으로의 이동은 IκB-α의 phosphorylation, ubiquitin의존적 proteasomal degradation에 의해서 일어나며 24) , NF-κB subunit 중 하나인 p65 단백질이 전사인자로서 작용하여 염증인자의 발현을 촉진시킨다. 탈명산이 NF-κB 신호전달 회로에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, RAW264.7 세포에 탈명산 추출액을 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 18시간 처리한 이후 100 ng/㎖의 LPS를 1시간 처리하여 세포질 및 핵 분획을 추출하였다. 탈명산 50, 100 ㎍/ ㎖은 LPS에 의해 증가하는 NF-kB p65 subunit의 핵내 축적을 효과적으로 억제하였으며, 또한 세포질에서의 IκB-α의 인산화를 억제하였다
이러한 결과는 탈명산의 염증 억제효능에 있어 NF-κB 신호전달회로의 억제가 관여함을 시사한다.
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Effect of TMS on LPS-induced nuclear translocation of NF-κB p65 and on the phosphorylation of IκB-α. The expression levels of NF-κB p65 and p-IκB-α were determined by western blotting using nuclear and cytosol extracts. Equal protein loading was verified by PARP or β-actin immunoblotting.
Ⅳ. 고 찰
탈명산은 同名異方이 다수 존재하며,『東醫寶鑑』내에도 동일한 이름의 처방이 6종 기록되어있고, 奪命이라는 이름을 포함한 유사한 명칭의 처방도 12 종이나 기록되어 있어 혼란을 부추기는 측면이 있다. 동일 명칭 처방은 Table 2 로, 유사 명칭 처방은 Table 3 으로 정리하였다. 이 중寒門에 기록되어 있는 처방은 獨蔘湯 이라는 명칭으로 더욱 유명하나『東醫』에는 奪命散이라는 명칭으로 기록되어 있으며, 유사 명칭 처방중에서 奪命丸은 계지, 복령, 목단피, 적작약, 도인으로 구성된 桂枝茯苓丸인데『東醫寶鑑』에서는 奪命丸의 이름으로 기록되어 있다. 이러한 처방명의 혼재는 임상 및 연구의 측면에 혼란을 가중시키는 면이 존재하므로 정리가 필요하다고 사료된다. 또한 동일 명칭의 구성 본초가 동일하거나 유사한 처방의 경우에도 근거로 삼은 고전문헌의 종류나 국내-국외의 다른 의료문화의 영향으로 구성 본초나 구성비, 용량이 각기 다른 경우가 다수 존재하므로 연구시나 evidence based medicine의 근거로 제시할 시에 유의하여 살펴볼 필요가 있다. 본 연구에서 구성 약재와 구성비는 박 등 2) 이 연구한 논문에서 제시된 바와『東醫寶鑑』에 기록된 바를 따라 수행하였다.
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염증 (Inflammation)은 생명체에서 발생하는 흔한 병리 증상 중의 하나로 제한적인 염증은 인체 내외의 환경적 자극에 대한 반응이며, 위험인자를 제거하고 세포와 조직의 재생에 필요하지만 25) , 장기간 지속된 염증반응은 암, 노화, 천식, 심혈관계 및 신경퇴행성 질환, 비만 및 비만과 관련된 인슐린 저항성 26)27)28) 등 다양한 상태 이상을 발생시킨다. 따라서 이러한 질병들을 관리하는데 항염증 작용을 가지는 약제들이 폭넓게 사용되고 있으며, 새로운 약제를 개발하고자 하는 연구도 지속적으로 진행되고 있다. 이 과정에서 천연물이 항염증제 개발의 데이터베이스로서 중요성이 부각되었으며 29) , 국내에서도 艾葉을 주 성분으로 하는 위염 치료제인 스티렌 정이 개발된 바 있다.
염증 반응에는 활성산소종 (Reactive oxygen species, ROS)과 활성질소종 (Reactive nitrogen species, RNS)이 관여한다. ROS와 RNS는 세포대사의 부산물로 생성되는데, macrophage 등의 면역 세포들에서 생성되는 ROS와 RNS들은 감염이나 염증반응에서 이물질을 제거하며, 면역계를 활성화시키는 역할을 하지만 30) , 과생산된 ROS는 단백질, 지질, DNA를 손상시키는데 31) , 이로 인하여 심장질환, 신경학적 문제, 암, 노화 등의 질병이 발생한다 32) . 따라서 염증 반응의 제어에 활성산소종과 활성질소종의 억제가 필요하며, 항산화효과가 있는 한약이 항염증 효과가 있을 개연성도 높다. 탈명산의 항산화 효과를 규명하기 위하여 in vitro 환경에서 DPPH radical, nitric oxide, peroxynitrite에 대한 소거능을 측정하였다. DPPH assay는 실험방법이 간단하고 신뢰성이 높아 항산화 효과를 측정하기 위하여 널리 사용된다. 그러나 Fig. 2A 에서 밝힌 바와 같이 탈명산은 DPPH radical을 소거하는 능력이 없었다. 하지만 nitric oxide와 peroxynitrite는 농도 의존적으로 소거하는 결과를 나타냈다 ( Fig 2B , Fig 2C ).
데이터는 논문에 수록하지 않았지만 superoxide anion (O 2 )의 소거능을 측정하였는데 실험을 반 복적으로 수행하였음에도 신뢰할 만한 데이터를 얻을 수 없었다. 아직은 결론을 내기 힘들지만 탈명산은 ROS를 소거하는 능력이 미미하며, RNS를 특이적으로 소거하는 것이 아닌가 사료되며, 추가적인 연구가 필요하리라 생각된다.
탈명산의 항염증 효과를 검증하기 위해 염증반응에 중요한 역할을 하는 대식세포인 RAW264.7을 이용한 실험에서 LPS를 처리하여 염증을 유도한 이후 실험을 실시하였다. RAW264.7 세포를 이용한 실험에서 양성대조군으로 AEBSF를 사용하였는데 AEBSF는 수용성의 안정하고 독성이 없는 물질로 NADPH oxidase를 억제하는 작용이있으며, 항염증 연구에 양성대조군으로 다용된다. 33)
먼저 DCFH-DA assay를 실시하여 LPS로 유도한 산화적 손상을 억제하는 능력을 실험하였다. DCFH-DA는 세포의 원형질 막에 침투한 후 free radical과 반응하여 dichlorofluorescein (DCF)를 형성한다. 대식세포에서 DCFH의 산화는 iNOS에 의해 생성된 intracellular NO를 관찰하는데 유용하다. 34) 35) 이 실험에서 탈명산은 산화적 손상을 낮은 농도에서도 효과적으로 억제하였다 ( Fig. 4 ). 이는 앞서 Fig. 2B 에서 볼 수 있는 결과와도 일치한다. 또한 griess regent system을 사용한 실험에서도 탈명산 메탄올 추출물은 NO를 농도 의존적으로 억제하는 결과를 보였다 ( Fig. 5A ). 또한 NO를 생성하는 효소인 iNOS를 western blotting으로 실험하였을 때 탈명산은 iNOS를 효과적으로 억제하였다. 이러한 결과로 미루어 보아 탈명산은 대식세포에서 iNOS의 발현을 억제함으로서 효과적으로 NO 생성을 억제한다고 결론을 내릴수 있었다.
COX-2는 일반적인 상황에서 대부분의 조직에서 발현되지 않지만, 자극이 발생하면 발현되어 염증의 과정에서 중요한 역할을 한다. 따라서 염증과 관련된 질환의 치료를 위해 COX-2의 발현을 조절할 필요가 있다 36) . COX-2는 arachidonic acid의 대사에 관여하여 prostaglandin E 2 를 생성하는데 37) 이를 억제하는 것이 NSAIDs의 중요한 목표가 된다. Fig. 7A 에서 확인할 수 있듯이 탈명산은 COX-2의 발현을 효과적으로 억제하였고, 고농도 (300 ㎍/㎖)에서 PGE 2 을 감소시키는 결과 를 보였다 ( Fig. 5B ).
염증 발생시 염증성 cytokine은 대식세포를 자극하여 COX-2와 iNOS를 발현시키는 역할을 하는 등 염증 발생과정에서 중요한 역할을 하는데, 본 연구에서는 IL-1β, IL-6, TNF-α를 ELISA kit를 사용하여 탈명산이 사이토카인을 감소시키는지 실험하였다. Fig. 6 에서 관찰할 수 있듯 탈명산은 IL-1β는 효과적으로 감소시키는 효과를 나타내었으나 TNF-α와 IL-6는 감소효과가 미미하였다. 이 결과로 미루어 보아 탈명산은 IL-1β에 특이적으로 작용하여 항염증 효과를 나타내는 것으로 판단된다.
또한 탈명산의 효과가 어떤 기전을 통해 나타나는지를 파악하기 위하여 NF-κB의 활성에 미치는 영향을 western blotting으로 실험하였다. NF- κB는 자극이 가해지지 않은 상태에서 p50과 p65 subunit의 형태로 억제인자인 IκB-α와 결합되어 cytosol에 존재하는데, LPS나 사이토카인 등의 자극이 발생하면, IκB-α는 인산화가 되며, NF-κ B는 핵으로 전위(translocation)되어 iNOS 및 COX-2나 proinflammatory cytokine 등의 염증인자를 발현시킨다 38)39) . 탈명산은 Fig. 8 에서 관찰할 수 있는 것처럼 NF-κB p65의 핵으로의 전위와 IκB-α의 인산화를 효과적으로 억제하였다.
결론적으로, 탈명산은 RNS를 억제하는 효과가 있었으며, 항염증 효과가 있어서 염증을 동반한 각종 질병의 치료제 개발에 응용할 수 있는 처방이라고 생각된다. 탈명산의 다양한 방면의 효과를 검증하기 위해 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
Ⅴ. 결 론
in vitro 환경에서 항산화 실험을 수행하고 마우스의 대식세포인 RAW264.7 세포를 대상으로 항염증 효과에 관한 제반 실험을 수행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
탈명산의 항산화 효과를 검증하기 위하여, DPPH radical, nitric oxide, peroxynitrite의 소거능을 측정한 결과 탈명산은 DPPH radical을 소거하지 못하였으나 RNS에 해당하는 nitric oxide와 peroxynitrite에는 효과가 있는 것으로 나타났다.
RAW264.7에 대한 탈명산의 세포독성을 알아보기 위하여 MTS assay를 수행한 결과, 300㎍/㎖의 농도 까지는 90% 이상의 세포생존률을 보였다.
RAW264.7 세포에 LPS를 처리하였을 때 유발되는 산화적 손상을 보호하는 효과가 있는지를 검토하기 위하여 DCFH-DA assay를 실시한 결과, 탈명산은 intracellular ROS를 통계적으로 유의하게 감소시켰다.
탈명산이 LPS에 의해 생성되는 NO 및 PGE 2 에 미치는 영향을 조사한 결과, NO를 농도 의존적으로 감소시켰으며, PGE 2 는 300㎍/㎖ 고농도 투여시 유효한 감소를 나타냈다.
RAW264.7 세포에서 LPS로 염증성 사이토 카인인 IL-1β, IL-6, TNF-α를 유도한 후 탈명산을 투여한 결과, IL-1β는 효과적으로 억제되었으나 IL-6와 TNF-α는 감소가 나타나지 않았다.
탈명산은 COX-2와 iNOS의 발현을 효과적으로 억제하였으며, 이러한 효과는 NF-κB pathway에서 NF-κB p65의 translocation과 IκB-α의 phosphorylation 을 억제함이 관여한다.
이러한 실험 결과들로 보아, 탈명산은 RNS를 억제하는 효과가 있으며 유효한 항염증 효과를 나타내, 염증을 동반한 다양한 질병의 치료제 개발에 응용할 수 있는 처방이라고 생각된다. 따라서 탈명산의 다양한 방면의 효과를 검증하기 위해 심도 깊은 연구가 요구된다.
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