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The Effect of the Curcumae Longae Rhizoma (CLR) Extract on the Hepatocellular Carcinogenesis and Acute Liver Damage Induced by Diethylnitrosamine (DENA) and CCl<sub>4</sub> in Rats
The Effect of the Curcumae Longae Rhizoma (CLR) Extract on the Hepatocellular Carcinogenesis and Acute Liver Damage Induced by Diethylnitrosamine (DENA) and CCl4 in Rats
Herbal Formula Science. 2014. Jun, 22(1): 177-192
Copyright © 2014, The Korean Academy of Oriental Medicine prescription
This paper is available at http//:www.ompak.okdanche.com which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
  • Received : May 25, 2014
  • Accepted : June 17, 2014
  • Published : June 30, 2014
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태산 정
창원 최
medijun@paran.com

Abstract
Objective :
In order to investigate the effect of Curcumae Longae Rhizoma(CLR) extract on the hepatocellular carcinogenesis and acute liver damage induced by diethylnitrosamine(DENA) and CCl 4 in rats.
Methods :
Experimental groups were subdivided into four; normal group (Nor), acute liver damage and hepatocellular cancer inducing control group (Con), and CLR extract 200㎎/㎏/day (CAA) or 400㎎/㎏/day (CAB) administered groups to Con. Thereafter the changes of the body weight, the liver weight and the weight of liver/100g body weight, total cholesterol, HDL cholesterol, triglyceride, the activities of AST, ALT, ALP, LDH, AFP, SOD, catalase were measured. And we observed by optical and electron microscopy.
Result :
1. The body weight was decreased in Con compared with Nor for 5 weeks, but increased in Con compared with Nor from 6 week to 9 week. During experimental period of total 9 weeks, CAA and CAB were increased compared with Con. 2. The liver weight was increased significantly (p<0.05) in Con compared with Nor. The weight of liver/100g body weight was increased significantly (p<0.05) in Con compared with Nor and decreased significantly (p<0.05) in CAB compared with Con. 3. The level of total cholesterol was increased in Con and CAA compared with Nor, but there was not statistically significant. The level of triglyceride was decreased in Con compared with Nor. But increased in CAA and CAB compared with Con. The level of HDL-cholesterol was significantly increased (p<0.05) in CAA and CAB compared with Con. 4. The activities of AST, ALT were increased in Con compared with Nor, but decreased in CAA compared with Con, significantly decreased (p<0.05) in CAB compared with Con. 5. The activities of ALP, LDH were increased in Con compared with Nor, but decreased in CAA and CAB compared with Con. 6. The activities of AFP was increased significantly (p<0.05) in Con compared with Nor, but decreased significantly (p<0.05) in CAA and CAB compared with Con. 7. The activities of SOD were increased in Con, CAA and CAB compared with Nor, but decreased in CAA and CAB compared with Con. The activities of Catalase was more increased in CAA and CAB compared than Con. 8. The results of light microscopical observation, a number of hepatocytes were damaged in Con compared with Nor and CAB. 9. According to the electron microscopical observation, irregular nuclear membrane, condensed nucleoplasm was observed in Con, the experimental group was observed in the nucleus of the well-preserved and evenly developed nucleoplasm.
Conclusions :
These results suggest that administration of CLR extract suppress or retard on the hepatocellular carcinogenesis and acute liver damage induced by DENA and CCl 4 in rats.
Keywords
I. 서 론
간은 인체의 모든 대사 기능의 중심이 되며 체내성 체외성 유독물질에 대한 해독작용을 하는 장기이기 때문에 간의 심한 손상은 인체기능의 치명적인 손상을 가져온다 1) . 간 손상의 원인으로는 바이러스의 감염, 약물중독, 지속적인 음주, 혈관장애, 대사장애 등이 있으며, 이로 인한 질환으로는 肝炎, 肝硬便症, 肝癌, 肝디스토마, 肝梅毒및 肝性昏睡 등이 있다 2) . 이러한 간 손상을 치유하기 위한 방법으로 천연물을 이용한 간 기능 보호제 또는 간 질환의 치료제 개발의 연구가 활발히 이루어지고 있으나 뚜렷한 효과를 나타내는 치료약제의 개발은 부족한 실정이다 1) .
간암은 세계적으로 가장 빈도가 높은 종양 중의 하나로 특히 아시아와 남부 아프리카에 많이 발생하며 3) , 국내에서는 2011년 현재 폐암에 이어 두 번째로 높은 사망률을 기록하고 있다 4) . 일반적으로 간암의 위험 인자로는 간경화증과 같은 만성 간질환을 들 수 있으며, 우리나라에서는 B형 및 C형 간염 바이러스, 알코올 등도 주요 위험인자로 알려져 있다 5) .
현재 간암 치료는 외과적 절제술을 기본으로 간 동맥 색전술, 국소치료법, 간 이식 등이 시행되고 있으나 우리나라 간암 환자의 대다수가 간기능이 저하된 간경변증을 동반하고 있어 수술이 가능한 경우는 많지 않다 6) . 또한 현재 시행하는 치료법으로는 암세포주에 대한 직접적인 살상을 목표로 하고 있기 때문에 세포독성 효과는 있지만 대부분 개체저항력을 떨어뜨리는 부작용이 있어, 최근에는 부작용이 적은 생약과 복합처방이 연구 대상이 되고 있다 7) .
최근 한의학에서 간암에 대해 진행되는 실험적 연구로는 간암에 대한 병태모델이나 간암세포주를 대상으로 하는 단일 약재 8-10) , 한약처방 11-13) , 약침액 투여 14-16) 의 유효성과 항암효과에 대한 연구가 이루어지고 있으며, 임상 증례 보고 17-19) 등을 통해 간암에 대한 한의학적 치료 방법을 연구하고 있다.
강황(Curcumae longae Rhizoma)은 생강과식물인 강황( Curcuma longa L .)의 根莖을 건조한 것으로 性味는 溫無毒 辛苦하고 肝, 脾經으로 歸經하며 破血行氣, 通經止痛 등의 效能으로 心腹痞滿脹痛, 經閉, 癓瘕, 風濕肩臂疼痛, 跌撲腫痛 등에 활용된다 20,21) . 이에 대한 연구로 항산화 효과 22) , 항균 효과 23) 등이 究明되었고, 다양한 암세포주를 이용한 실험 24-26) 에서 항암 효과가 있다고 증명되었으나 실험동물에 암을 유발시킨 후 약물을 경구 투여하여 관찰한 연구모델은 없었다.
이에 저자는 diethylnitrosamine과 CCl 4 로 간 손상과 간암을 유발시킨 후, 강황 추출액의 항암효과와 간 손상에 미치는 영향을 究明하기 위하여 체중과 간 중량의 변화, 혈청지질의 변화, transaminase (AST, ALT)의 활성, alkaline phosphatase (ALP)와 lactate dehydrogenase (LDH)의 활성, superoxide dismutase (SOD)와 catalase의 활성, 간조직의 광학현미경 관찰, 간세포의 전자현미경 관찰 등을 통해 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
II. 재료 및 방법
- 1. 재료
1) 실험동물
실험은 동물실험 윤리위원회의 승인을 얻어 시행하였으며, 동물관리 규정을 준수하였다. 체중200±10 g 내외의 7주령 흰쥐(Sprague Dawley)를 샘타고(오산, 한국)로부터 구입하였다. 실험동물은 동신대학교 한의과대학 동물사육실에서 일정한 조건(온도 : 21±2℃, 습도 : 50-60%, 12시간 주기 명/암)하에서 일반 고형사료(샘타코, 흰쥐 용)와 물을 충분히 공급하면서 1주 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
2) 약재 및 약물 추출
본 실험에 사용한 강황(Curcumae longae Rhizoma)은 중국산 강황( Curcuma longa L.)을 동신대학교 부속한방병원에서 2012년 3월에 구입한 후 정선하였으며, 약물 추출은 강황 40 g 을 물 900 ㎖에 넣고 약탕기로 3시간 동안 가열한 다음 농축한 후 저온순환수조(COOL ACE CA-1500)에서 1차 동결한 다음 동결건조기(Samwon, SFDSMO06, 한국)로 동결 건조하여 5.5 g 의 분말을 얻었다.
- 2. 방법
1) 간 손상 및 간암 유발
정상군을 제외한 모든 실험동물은 diethylnitrosamine(DENA, Sigma Chemical Co., St Louis, MO) 200 ㎎/㎏을 0.9% 식염수 1 ㎖에 용해하여 1주 간격으로 2회 복강투여 하였다. DENA투여 1주후부터 carbon tetrachloride(CCl 4 , Sigma Chemical Co., St Louis, MO)와 corn oil을 1:1로 희석한 약물 1 ㎖을 1주 간격으로 3회 복강 투여하여 간 손상과 간암을 유발하였다.
2) 실험군 설정 및 약물 투여
정상군은 통상적인 사료와 물을 공급하였으며, 대조군은 간 손상과 간암이 유발된 후부터 식염수 0.5 ㎖을 실험기간 동안 매일 구강 투여하였다. 실험군은 실험기간 (9주) 동안 매일 강황추출액 건조분말을 음용수에 용해하여 200 ㎖/㎏ (이하 CAA군)와 2배에 해당하는 400 ㎖/㎏ (이하 CAB군)을 구강 투여하였다.
- 3. 관찰방법
1) 체중 측정
대조군과 실험군의 체중은 1주 간격으로 실험기간 동안 측정하였으며, 체중 측정 12 시간 전부터 금식시켰다.
2) 간 중량 측정
흰쥐의 간 중량 측정을 위하여 실험기간인 9주후 urethane(0.75 ㎎/㎏)을 복강 투여하여 마취하였다. 흉강을 열고 심장 채혈한 다음 간을 적출하였고, 생리식염수로 세척한 다음 수분을 제거하고서 chemical balance(Saturous, USA)를 이용하여 측정하였다. 간의 무게는 실험동물 체중 100 g 당 무게로 환산하였다.
3) Total cholesterol, HDL cholesterol, Triglyceride 함량 측정
혈액은 시험관에 넣어 실온에서 30분간 방치하여 혈액을 응고시킨 다음 3,000 rpm 에서 원심분리하여 혈청을 얻었다. Total cholesterol은 Allain등의 방법 27) 에 따라 546 ㎚ 파장에서, HDL cholesterol은 Warnick와 Albers의 방법 28) 에 따라 546 ㎚ 파장에서, triglyceride는 McGowan 등의 방법 29) 에 따라 505 ㎚ 파장에서 측정하였으며, 모든 시약은 Kit (ELITECH, France)를 사용하였다.
4) 혈청 Transaminase 활성 측정
혈청 중 aspartate aminotransferase(AST)와 alanine aminotransferase (ALT)의 활성 측정은 Reitman-Frankel의 방법 30) 에 따라 kit 시약(아산제약, 한국)을 사용하여 측정하였다. AST와 ALT기질액 1.0 ㎖을 시험관에 넣고 37 ℃에서 5분간 방치한 다음 혈청 0.2 ㎖을 넣어 잘 혼합한 후 37℃에서 AST는 60분, ALT는 30분간 반응시킨 다음 정색 시액 1.0 ㎖을 첨가하여 잘 혼합하여 실온에서 20분간 방치하여 반응을 종료시키고, 0.4N NaOH 용액 10 ㎖을 가하여 잘 혼합한 다음 실온에서 약 10분간 방치하였다가 505 ㎚에서 흡광도(photometer 5010, Robert Riele GmbH, Germany)의 변화를 측정하였다.
5) Alkaline phosphatase(ALP) 함량 측정
ALP 활성도 측정은 Reitman-Frankel 방법 30) 에 의한 kit 시약(아산제약, 한국)을 사용하여 405 ㎚에서 측정하였다.
6) Lactate dehydrogenase(LDH) 함량 측정
LDH 활성도 측정은 Reitman-Frankel 방법 30) 에 의한 kit 시약(아산제약, 한국)을 사용하여 340 ㎚에서 측정하였다.
7) 혈청 AFP 측정
심장채혈하여 획득한 혈액(10 ㎕)을 증류수 40 ㎕에 희석하였다. 혈액 샘플은 AFP를 측정하기 전까지 −80 ℃ 초저온 냉동고에 보관하였다. 그 다음 AFP ELISA kit(Sierra Resources International, Inc., Valrico, FL)를 이용하여 완충액에 희석된 혈액 샘플 10 ㎕에서 혈청내 AFP 농도를 측정하였으며, 제조사의 실험방법에 따라 수행하였다.
8) Superoxide Dismutase (SOD) 활성도 측정
대조군과 실험군 흰쥐로부터 혈청을 수집하고, 이를 원심분리한 후 얻은 상층액을 SOD 활성을 측정하기 위한 효소원으로 이용하였다. 단백질 정량은 Bio-Rad assay를 이용하였으며, −70 ℃의 deep freezer에 보관하면서 실험에 이용하였다. SOD 활성도는 SOD assay kit(Dojindo, Japan)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정한 후 SOD 활성도를 계산하였다.
9) Catalase 활성도 측정
Catalase 활성도 측정은 Beers and Sizer의 방법 31) 에 준하여 50 mM 인산칼슘 완충액(pH 7.2)에 기질인 10 mM H 2 O 2 와 효소액을 가하여 최종 반응액이 3.0 ㎖이 되게 한 다음 25℃에서 30초간 반응시키면서 240 ㎚ 파장에서 소실되는 H 2 O 2 의 양을 측정하였다. 효소 활성도의 단위는 15초 간에 1 ㎎의 단백이 반응하여 환원시킨 H 2 O 2 를 ㎛ 로 나타내었다.
10) 광학현미경 관찰
흰쥐의 간 조직을 적출하고 Bouin 용액을 사용하여 24시간 동안 고정시킨 다음, 30, 50, 70, 90, 95, 100Ⅰ, 100Ⅱ와 같이 알코올 농도를 상승시켜 탈수한 다음 xylene으로 투명화 과정을 거친 후 paraffin으로 포매하였고, 포매된 조직을 microtome을 사용하여 5 ㎛ 두께로 절편하였다. 절편한 조직을 slide glass 위에 부착시키고 xylene으로 paraffin 을 제거한 다음 100%, 90%, 80% ethanol 과 같이 농도가 낮아지는 순으로 5분씩 담구어 함수과정을 거치게 하였다. Hematoxylin과 Eosin으로 이중염색을 한 다음 탈수하였다. Canada balsam으로 봉합한 후 카메라 부착 광학현미경(Olympus BX51, Japan)으로 관찰한 후 사진을 촬영하였다.
11) 전자현미경 관찰
전자현미경 관찰을 위하여 광학현미경 시료와 동일한 부위의 조직을 절취하여 전고정액 속에서 1 ㎣ 크기로 세절한 후 2.5 % glutaraldehyde (phosphate buffer, pH 7.4)로 2시간 동안 전고정 하였다. 전고정이 끝난 조직은 동일 완충액을 사용 10분 간격으로 3회 세척한 다음 1 % osmium tetroxide(O s O 4 )로 2시간 동안 고정 한 다음 동일 완충액으로 3회 세척하였다. 세척 후 시료들은 상승농도 순의 에탄올로 탈수하여 propylene oxide로 치환한 다음 Epon-Araldite 혼합액으로 포매하였고 60℃ 오븐에서 30시간 중합시켰다. 포매된 조직들을 LKB-V형 ultramicrotome을 사용하여 1 ㎛두께로 절편을 제작하고 1 % toluidine blue로 hot plate(60℃)상에서 염색하였다. 염색된 시료를 광학현미경으로 관찰하여 조직을 확인한 다음 동일한 부위에서 60 ㎚두께로 초박절편을 제작하여 silver grid에 부착하였고, uranyle acetate와 lead citrate로 이중 염색한 다음 JEM 100 CX-II 투과형 전자현미경(Jeol Ltd, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
12) 통계분석
실험에서 얻은 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 통계 분석은 Student's t-test와 one-way ANOVA test를 통하여 p-value 값이 0.05 미만일때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
III. 결 과
- 1. 체중의 변화
흰쥐의 체중 변화를 측정한 결과, 대조군의 체중은 정상군에 비하여 5주까지는 감소하였으나 6주 이후부터는 정상군 보다 증가하기 시작하였다. 실험군의 체중은 대조군에 비하여 모든 실험기간동안 증가하였다( Fig. 1 ).
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The changes of body weight during 9 weeks. Nor, administered saline; Con, control group administered saline after DENA and CCl4 treatment; CAA group administered CLR extract 200 ㎎/㎏/day or CAB group administered CLR extract 400 ㎎/㎏/day during 9 weeks after DENA and CCl4 treatment. (n=6)
- 2. 간 중량 및 체중 100g 당 간 중량의 변화
1) 간 중량
간 중량을 측정한 결과 정상군(11.0±0.32 g)에 비하여 대조군(14.18±0.45 g)은 유의성( # p<0.05) 있게 증가하였고, CAA군(13.91±0.49 g)과 CAB군(13.15±0.70 g)은 대조군에 비해 감소하였으나 유의성은 없었다( Fig. 2A ).
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The comparison of liver weight from 9 weeks groups. Nor, administered saline; Con, control group administered saline after DENA and CCl4 treatment; CAA, CLR extract 200 ㎎/㎏/day administered group; CAB, CLR extract 400 ㎎/㎏/day administered group during 9 weeks after DENA and CCl4 treatment. All values are mean ± S.E. Significant differences were compared with normal at #p <0.05. (n=6)
2) 체중 100g 당 간 중량
흰쥐의 체중 100g 당 간의 중량을 측정한 결과 정상군(2.22±0.05 g)에 비하여 대조군(2.85±0.09 g)은 유의성( # p<0.05)있게 증가하였으며, CAA군(2.73±0.10 g)과 CAB군(2.41±0.07 g)은 대조군에 비하여 감소하였고, 특히 CAB군은 유의성( * p <0.05)있게 감소하였다( Fig. 2B ).
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Comparison of liver weight per 100g body weight from 9 weeks groups. Nor, administered saline; Con, control group administered saline after DENA and CCl4 treatment; CAA, CLR extract 200 ㎎/㎏/day administered group; CAB, CLR extract 400 ㎎/㎏/day administered group during 9 after DENA and CCl4 treatment. All values are mean ± S.E. Significant differences were compared with normal at #p <0.05. or control at *p <0.05 (n=6)
- 3. 혈청 지질 함량의 변화
1) 총 콜레스테롤 함량
총 콜레스테롤의 함량을 측정한 결과 정상군(72±3.21 ㎎/㎗)에 비하여 대조군(79±3.87 ㎎/㎗)과 CAA군(80±4.06 ㎎/㎗)에서 약 10 % 증가하였으나, 통계적인 유의성은 없었으며, CAB군(71±6.13㎎/㎗)은 대조군에 비해 낮게 측정되었으나 유의성은 없었다( Fig. 3 ).
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The changes of cholesterol concentration from 9 weeks groups. Nor, administrated saline; Con, control group administrated saline after DENA and CCl4 treatment; CAA group administrated CLR extract 200 ㎎/㎏/day or CAB group administrated CLR extract 400 ㎎/㎏/day during 9 weeks after DENA and CCl4 treatment. All values are mean ± S.E. (n=6)
2) Triglyceride의 함량
중성지방의 함량을 측정한 결과 정상군(74±6.31 ㎎/dL)에 비하여 대조군(64±7.40 ㎎/dL)이 약 14% 감소하였으며, CAA군(71±10.0㎎/dL)과 CAB군(75±15.62 ㎎/dL)은 대조군보다 증가하였으나 통계적인 유의성은 없었다( Fig. 4 ).
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The changes of triglyceride concentration from 9 weeks groups. Nor, administrated saline; Con, control group administrated saline after DENA and CCl4 treatment; CAA group administrated CLR extract 200 ㎎/㎏/day or CAB group administrated CLR extract 400 ㎎/㎏/day during 9 weeks after DENA and CCl4 treatment. All values are mean ± S.E. (n=6)
3) HDL-콜레스테롤 함량
HDL-콜레스테롤 함량을 측정한 결과 정상군(46±1.38 ㎎/㎗)에 비하여 대조군(42±1.53 ㎎/㎗)에서는 감소하였으나 유의성은 없었으며, CAA군(57±4.55 ㎎/㎗)과 CAB군(51±3.17 ㎎/㎗)은 대조군에 비하여 유의성(*p<0.05)있게 증가하였다( Fig. 5 ).
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The changes of HDL concentration from 9 weeks groups. Nor, administrated saline; Con, control group administrated saline after DENA and CCl4 treatment; CAA group administrated CLR extract 200 ㎎/㎏/day or CAB group administrated CLR extract 400 ㎎/㎏/day during 9 weeks after DENA and CCl4 treatment. All values are mean ± S.E. Significant differences were compared with control at *p<0.05. (n=6)
- 4. 혈청 Transaminase 활성의 변화
1) Aspartate aminotransferase(AST) 활성
AST의 활성을 측정한 결과 정상군(80±5.46 U/L)에 비하여 대조군(163±26.50 U/L)이 유의성(#p<0.05)있게 증가하였으며, CAA군(105±11.63 U/L)과 CAB군(93±10.62 U/L)은 대조군에 비하여 감소하였고, 특히 CAB군은 대조군에 비하여 유의성(*p<0.05)있게 감소하였다( Fig. 6 ).
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The changes of AST activities from 9 weeks groups. Nor, administrated saline; Con, control group administrated saline after DENA and CCl4 treatment; CAA group administrated CLR extract 200 ㎎/㎏/day or CAB group administrated CLR extract 400 ㎎/㎏/day during 9 weeks after DENA and CCl4 treatment. Significant differences were compared with normal/control at #p<0.05/*p<0.05. All values are mean ± S.E. (n=6)
2) Alanine aminotransferase(ALT) 활성
ALT의 활성을 측정한 결과 정상군(25±1.38 U/L)에 비하여 대조군(46±2.56 U/L)이 유의성(#p<0.05)있게 증가하였고, CAA군(35±4.36 U/L)과 CAB군(29±1.0 U/L)은 대조군에 비하여 감소하였으며, 특히 CAB군은 대조군에 비하여 유의성(*p<0.05)있게 감소하였다( Fig. 7 ).
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The changes of ALT activities from 9 weeks groups. Nor, administrated saline; Con, control group administrated saline after DENA and CCl4 treatment; CAA group administrated CLR extract 200 ㎎/㎏/day or CAB group administrated CLR extract 400 ㎎/㎏/day during 9 weeks after DENA and CCl4 treatment. Significant differences were compared with normal/control at #p<0.05/*p<0.05. All values are mean ± S.E. (n=6)
- 5. Alkaline phosphatase(ALP) 활성의 변화
ALP의 활성을 측정한 결과 정상군(383±14.0 U/L)에 비하여 대조군493±52.13 U/L)은 증가하였고, CAA군(436±36.72 U/L), CAB군(435±24.28 U/L)은 대조군에 비하여 감소하였으나, 통계적인 유의성은 없었다( Fig. 8 ).
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The changes of Alkaline phosphatase activities from 9 weeks groups. Nor, administrated saline; Con, control group administrated saline after DENA and CCl4 treatment; CAA group administrated CLR extract 200 ㎎/㎏/day or CAB group administrated CLR extract 400 ㎎/㎏/day during 9 weeks after DENA and CCl4 treatment. All values are mean ± S.E. (n=6)
- 6. Lactate dehydrogenase(LDH) 활성의 변화
LDH 활성을 측정한 결과 정상군(463±118.05㎎/㎗)에 비하여 대조군(626±107.30 ㎎/㎗)이 약35% 증가하였고, CAA군(571±108.15 ㎎/㎗)과 CAB군(485±70.79 ㎎/㎗)은 대조군에 비해 감소하였으나 유의성은 없었다( Fig. 9 ).
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The changes of Lactate dehydrogenase activities from 9 weeks groups. Nor, administrated saline; Con, control group administrated saline after DENA and CCl4 treatment; CAA group administrated CLR extract 200 ㎎/㎏/day or CAB group administrated CLR extract 400 ㎎/㎏/day during 9 weeks after DENA and CCl4 treatment. All values are mean ± S.E. (n=6)
- 7. 혈청 Alpha fetoprotein (AFP) 활성의 변화
혈청 AFP의 농도를 측정한 결과 정상군(5.67±0.29ng/㎖)에 비하여 대조군(17.1±0.96 ng/㎖)에서는 약 99% 증가하여 통계적으로 유의성(#p<0.05)을 나타냈다. CAA군(3.61±0.52 ng/㎖)과 CAB군(3.37±0.37ng/㎖) 또한 대조군에 비하여 통계적으로 유의성 (*p<0.05)있게 감소하였다( Fig. 10 ).
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The changes of alpha fetoprotein from 9 weeks groups. Nor, administrated saline; Con, control group administrated saline after DENA and CCl4 treatment; CAA group administrated CLR extract 200 ㎎/㎏/day or CAB group administrated CLR extract 400 ㎎/㎏/day during 9 weeks after DENA and CCl4 treatment. All values are mean ± S.E. Significant differences were compared with normal/ control at #p<0.05/*p<0.05. (n=6)
- 8. SOD와 Catalase의 활성의 변화
1) SOD의 활성
SOD의 활성을 측정한 결과 정상군(28±6.88 %)에 비하여 대조군(34±5.87 %)은 증가하였고, CAA군(29±7.37 %)과 CAB군(28±6.98 %)은 대조군보다는 감소하였으나 통계적인 유의성은 없었다( Fig. 11 ).
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The change of SOD activities from 9 weeks groups. Nor, administered saline; Con, control group administered saline after DENA and CCl4 treatment; CAA, CLR extract 200 ㎎/㎏/day administered group; CAB, CLR extract 400 ㎎/㎏/day administered group during 9 weeks after DENA and CCl4 treatment. All values are mean ± S.E. (n=6)
2) Catalase의 활성
Catalase 활성을 측정한 결과 정상군(0.236±0.01 U/㎎ protein)에 비하여 대조군(0.230±0.00U/㎎protein)에서 가장 낮게 나타났으며, CAA군(0.243±0.02 U/㎎ protein)과 CAB군(0.243±0.00 U/mL)은 대조군보다 높은 활성을 보였으나 통계적인 유의성은 없었다( Fig. 12 ).
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The change of catalase activities from 9 weeks groups. Nor, administered saline; Con, control group administered saline after DENA and CCl4 treatment; CAA, CLR extract 200 ㎎/㎏/day administered group; CAB, CLR extract 400 ㎎/㎏/day administered group during 9 weeks after DENA and CCl4 treatment. All values are mean ± S.E. (n=6)
- 9. 간조직의 변화
정상군의 간 조직은 타원형의 중심정맥과 함께 일정한 크기의 세포핵을 갖고 있었으며 세포질은 거의 일정하게 eosin에 대한 염색성을 보였고, 동굴모세혈관에는 혈액이 충만되어 있었다( Fig. 13A ).
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Histological sections of liver of rats in response to CLR extracts in the DENA and CCl4-induced liver injury. A, Normal group; B, Control group administered saline during 9 weeks, Arrows indicate ipid droplets and arrow heads indicate giant nuclei.; C, CLR extract (200 ㎎/㎏ /day) administered group during 9 weeks, A number of cancer cells(CC) are observed in the right side,; D, CLR extract (400 ㎎/㎏/day) administered group during 9 weeks. CV, central vein. Hematoxylin-Eosin stain. Original magnification × 100.
대조군은 중심정맥 주변에 많은 지방방울들이 관찰되었으며, 조직 전반에 걸쳐 암세포로 진행중인 커다란 핵을 갖는 간세포들이 다수 관찰되었다( Fig. 13B ).
CAA군에서는 대조군과 유사하게 조직 전반에 걸쳐 지방방울들이 다수 관찰되었으며, 암세포의 집단이 관찰되기도 하였다( Fig. 13C ). CAB군은 타원형의 중심정맥을 중심으로 동굴모세혈관들이 관찰되었고, 암세포로 변화하는 큰 핵을 갖는 간세포는 거의 관찰되지 않았으며, 암세포 집단 또한 거의 관찰되지 않았다( Fig. 13D ).
- 10. 간세포의 미세구조변화
정상군 간세포의 미세구조를 관찰한 결과 핵막이 뚜렷하고 핵질이 고르게 발달해 있었다. 과립세포질세망이 발달해 있었으며, 사립체는 둥근 모양이었다. 당원과립들이 세포질 전반에 걸쳐 있었으며, 지방방울들은 동굴모세혈관 주변 세포질에서 다수 관찰되었다( Fig. 14A - B ).
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Electron micrograph of hepatocytes from the 9 weeks normal group. A. Electron micrographs showing scattered rough endoplasmic reticulum(rER) and a number of mitochondria. B. A number of lipid droplets(L) are observed near the sinuoid Kupffer cell(KC). N, nucleus; RBC, red blood cell; M, mitochondria. Bar indicate 500 nm.
대조군 간세포의 미세구조를 관찰한 결과 핵의 크기가 세포질에 비하여 비교적 크게 관찰되었으며, 핵막의 경계가 뚜렷하지 않고 불규칙하였다. 무수히 많은 사립체들이 관찰되었는데 cristae의 발달은 미약하였으며, 기질의 전자밀도는 낮게 관찰되었다( Fig. 15A ). 반면 세포질에서는 발달된 과립세포질세망과 당원과립의 집단들이 세포질 곳곳에서 관찰되었고 세포질 전반에 걸쳐 소수의 지방방울이 관찰되었다. 또한 동굴모세혈관에서는 백혈구와 적혈구들이 관찰되었다( Fig. 15B ).
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Electron micrograph of hepatocytes from the 9 weeks control group. A. Electron micrographs showing a lot of mitochondria(M) which contain electron lucent matrix. B. A white blood cell(WBC) and red blood cell(RBC) are observed in the sinusoid. L, lipid droplet; N, nucleus; P, polysome. Bar indicate 500 nm.
실험군인 CAA군에서 미세구조를 관찰한 결과 뚜렷한 핵막과 고른 핵질, 다수의 층판구조를 이룬 과립세포질세망과 발달된 골지체가 관찰되었다. 사립체들은 세포질 전반에 걸쳐 다수 관찰되었는데 cristae가 발달하였으며, 사립체 기질의 전자밀도는 대체로 높게 나타났다( Fig. 16A ). 대부분의 간세포의 핵은 핵소체가 발달해 있었으며, 동굴모세혈관의 Kupffer 세포는 전자밀도가 매우 높은 다양한 형태의 물질들을 내포하고 있는 것이 관찰되었다( Fig. 16B ).
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Electron micrographs of hepatocytes from the CAA group. A, The rough endnoplasmic reticulum(rER) and Golgi complex(Go) are well developed, and forms aggregates of parallel. B. A lot of electron dense material are observed in the sinusoids. KC, Kupffer cell; L, lipid droplet; M, mitochondria; N, nucelus. RBC, red blood cell. Bar indicate 500 nm.
CAB군에서 미세구조는 간세포의 뚜렷한 핵막과 발달된 핵질, 커다란 핵소체가 관찰되었다. 세포질 전반에 걸쳐 발달된 층판구조를 이루고 있는 과립세포질세망, 사립체들의 cristae, 다수의 용해소체들이 관찰되었다( Fig. 17A ). 동굴모세혈관에서는 림프구와 백혈구가 다수 관찰되었는데, 백혈구의 세포질에서는 특이적으로 많은 사립체들과 소포들, 용해소체들이 관찰되었다.( Fig. 17B ).
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Electron micrograph of hepatocytes from the CAB group. A. The rough endnoplasmic reticulum(rER) are well developed, Arrows indicate lysosomes. B, A lot of lysosomes are observed in the peripheral cytoplasm(right upper portion). B. A lymphocyte(Lym) and a white blood cell(WBC) are observed in the sinusoid. Arrows indicate lysosomes. L, lipid droplets; N, nucelus. Bar indicate 500 nm.
IV. 고 찰
암은 뇌혈관 질환, 심장 질환과 더불어 우리나라의 3대 사망 원인 중 하나이다 4) . 이중 간암은 2009년 현재 갑상선암, 위암, 대장암, 폐암에 이어 다섯 번째로 발생률이 높고 32) , 2011년 현재 폐암에 이어 두 번째로 높은 사망률을 보이며, 2011년 현재 인구 10만 명당 남자는 32.8명, 여자는 10.9명이 간암으로 사망하고 있다 4) .
간암은 다른 암에 비해 예후가 불량한 편인데, 이는 종양 생물학의 특성상 성장과 침윤이 빠르고, 대부분의 간세포암이 만성 간염이나 간경화증을 동반하며 간암이 상당히 진행된 상태에서 발견되어 근치적 치료가 어렵기 때문이다 33) . 현재 간암 치료는 간 절제술, 간동맥 화학 색전술, 국소치료법, 간이식 수술 등이 시행되고 있으며, 외과적 절제술이 기본으로 시행되고 있으나 간암환자의 약 80%에서 간 기능이 저하된 간경변증을 동반하고 있어 수술이 가능한 경우는 많지 않다 6) . 또한 장기 생존 및 완치를 기대할 수 있는 간 절제술의 경우에도 5년 내 재발률이 55-80%에 이르는 실정이므로 비수술적인 치료가 점차 대두되고 있는 실정이다 34) .
간암은 한의학적으로 脇痛, 鼓脹, 蟲門, 積聚, 黃疸등의 범주에 속하며 2) , 간암에 대한 변증으로는 氣滯血瘀, 濕熱結毒, 肝氣鬱結, 肝膽濕熱, 肝脾兩虛, 精氣虧損, 肝陰不足, 肝腎陰虛 등이 있으며, 疏肝理氣, 活血化瘀, 淸熱利濕, 益氣健脾 등의 치법으로 다양한 처방을 응용하고 있으나 이에 대한 체계적인 연구는 거의 없는 실정이다 35) .
본 실험에 사용된 강황(Curcumae longae Rhizoma)은 活血祛瘀藥에 속하며, 생강과 식물인 강황( Curcuma longa L.)의 根莖을 건조한 것으로 破血行氣, 通經止痛 등의 效能으로 心腹痞滿脹痛, 經閉, 癓瘕, 風濕肩臂疼痛, 跌撲腫痛 등을 치료하고, 혈압 강하·항균 등의 약리 작용을 가지고 있는 것으로 알려져 있다 20,21) .
강황에 대한 연구로는 항산화 효과 22) , 항균 효과 23) 등이 究明되었고, 다양한 암세포주를 이용한 실험 24-26) 에서 항암 효과가 있다고 증명되었으나 실험동물에 암을 유발시킨 후 약물을 경구 투여하여 관찰한 연구모델은 없었다.
실험에 사용된 DENA는 그 자체가 암발생의 개시인자 및 촉진인자의 성질을 가지고 있고, 저농도의 양을 흰쥐에 음용시키기만 하여도 암종으로 진행되어 암화 과정의 연속적인 생화학적 및 병리학적 연구를 하는데 유용하게 사용되고 있다 36) . CCl 4 는 cytochrome p450에 의하여 CCl 3 free radical이 생성되어 세망내피계(endoplasmic reticulum)에서 불포화지방산을 공격하여 지질과산화가 일어나므로 세포막과 간효소에 손상을 일으키고, 미토콘드리아의 작용이 저하되어 간세포괴사에 이르게 하여 37) 간의 지방변성, 괴사, 섬유화를 유발시켜 간 손상 실험에 광범위하게 사용되고 있으며, 또한 DENA와 CCl 4 를 병용 투여한 실험들 38,39) 도 다수 진행되었다.
이에 저자는 강황이 DENA와 CCl 4 로 유발된 흰쥐의 간암 형성과 간 손상에 미치는 영향을 확인하기 위해 간암과 간 손상을 유발시킨 후, 9주동안 강황 추출물을 투여하여 200 ㎎/㎏ (CAA군)과 400 ㎎/㎏ (CAB군)으로 나누어 투여한 후 체중과 간 중량의 변화, 혈청지질의 변화, transaminase(AST, ALT)의 활성, alkaline phosphatase (ALP)와 lactate dehydrogenase (LDH)의 활성, superoxide dismutase (SOD)와 catalase의 활성, 간조직의 광학현미경관찰, 간세포의 전자현미경 관찰을 시행하였다.
일반적으로 종양 환자의 경우 현저한 식욕부진과 함께 탈수증상이 수반되며, 이로 인한 만성적인 체중감소가 초래되고 40) , 간암 환자의 경우도 절반 이상에서 영양불량 및 흡수장애로 인한 만성적인 체중감소가 발생한다 41) . 체중 측정 결과 대조군의 체중은 정상군에 비하여 5주까지는 감소하였으나 6주 이후부터는 정상군 보다 증가하기 시작하였고, 실험군의 체중은 대조군에 비하여 모든 실험기간 동안 증가하였다. 간암 발생 시 간의 무게 및 체중에 대한 간무게는 체중과 반비례하여 증가하는 경향이 있는데 42) , 간 중량 및 체중 100 g 당 간 중량 측정 결과, 간 중량은 정상군에 비해 대조군, CAA군, CAB군 모두 증가하였지만 대조군에 비하여 CAA군, CAB군 모두 감소하였으며, 체중 100 g 당 간 중량 변화에서는 대조군에 비해 CAB는 통계적으로 유의성 있게 감소하였다.
간암으로 인해 간실질 장애가 심하게 되면 혈청 cholesterol 농도는 감소하는 경향을 보이는데 43) , 본 실험에서는 총 콜레스테롤 함량의 변화는 유의성이 없었다. 그러나 triglyceride의 함량은 CAA군과 CAB군에서 모두 대조군에 비해 증가하였고, CAA군과 CAB군의 HDH-cholesterol 함량도 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 증가하였다.
간세포의 손상을 검사하기 위하여 임상적으로 흔히 혈청내의 AST, ALT, ALP, LDH와 같은 효소의 활성도를 검사하는데 44) , 혈청내에서의 AST, ALT 활성치 증가는 간세포의 장애 정도와 비교적 상관성이 높고, 간에서 혈액으로 유출되는 다른 효소에 비해 예민하게 변동된다 30) . ALP는 간염, 간경변, 폐쇄성 황달, 기타 간담도계질환 등이 있을 때 증가하고 45) , 당분해 주효소인 LDH의 활성도는 종양조직에서는 당분해 활성도가 정상조직에 비해 증가되므로 증가하게 된다 46) . 본 연구에서도 diethylnitrosamine (DENA)와 CCl4로 처리한 대조군의 AST,ALT 활성도가 정상군에 비하여 유의성 있는 상승을 보여 간독성이 유발됨을 알 수 있었고, CAA군과 CAB군에서 AST와 ALT의 활성도가 대조군에 비해 감소하였으며 특히 CAB군은 대조군에 비하여 통계적으로 유의성있게 감소하였다. ALP와 LDH 활성에서 CAA군과 CAB군 모두 정상군보다 증가되었지만 대조군에 비해 활성도가 다소 감소되어 강황이 간손상에 따른 효소 활성 을 억제시킴을 알 수 있었다.
혈청 AFP는 출생 후에는 빠르게 혈중에서 사라져 출생 직후에 검출되지 않을 정도로 감소하다가 간세포암 등의 병적 상황이 되면 다시 증가하게 되므로 임상적으로 유용한 종양표지자와 선별검사의 방법으로 사용되고 있다 47) . 본 실험에서는 정상군에 비해 대조군이 유의성 있게 증가하였으며, 대조군에 비해 실험군 전체에서 통계적으로 유의성 있는 감소를 보였다.
활성산소는 산소 대사 과정이나 환경적인 요인에 의해 발생되는데, 자체 반응성이 매우 강하여 유전자 돌연변이를 발생시키거나 종양억제 유전자를 불활성화시켜 암 유발 인자로 작용한다 48) . SOD는 산소 대사 과정에서 가장 먼저 생성되는 활성산소를 제거하는 효소이며 49) , Calalase는 체내에서 지방의 자동 산화 및 유기물의 산화로 생기는 H 2 O 2 를 H 2 O와 O 2 로 분해하여 무독화 시키는 활성산소제거 효소이다 50) . SOD 및 Catalase를 측정함으로 써 체내활성산소와 간암과의 연관성을 유추해 볼수 있는데, SOD의 활성도를 측정한 결과 정상군에 비해 대조군은 증가 하였고 실험군 모두 대조군 보다 감소하였으나 통계적으로 유의성은 없었다. Catalase의 활성도를 측정한 결과 대조군은 정상군에 비해 감소하였으며, CAA군과 CAB군은 정상군과 대조군에 비해 증가하었다. 이는 강황이 체내활성산소를 제거하여 간세포의 사멸을 억제하는 것으로 사료되나 통계적인 유의성이 없어 활성산소에 관련하여 추가적인 실험이 필요하다고 사료된다.
광학 현미경을 통해 간조직의 변화를 관찰한 결과 정상군에서는 타원형의 중심정맥, 방사형의 동굴모세혈관, 일정한 eosin에 대한 염색성을 보였다. 반면 대조군에서는 조직 전반에 걸쳐 커다란 핵을 갖는 세포들과 암세포의 집단들이 다수 관찰되었으며, 중심정맥 주변에 많은 지방방울을 관찰할 수 있었다. CAA군은 대조군과 큰 차이가 없었으나, CAB군은 타원형의 중심정맥을 중심으로 동굴모세혈관들이 관찰되었으며, 암세포로 변화하는 커다란 핵을 갖는 세포와 암세포 집단은 거의 관찰되지 않았다.
전자현미경 관찰 결과 대조군의 간세포에서는 불규칙한 핵막, 응축된 핵질, cristae의 발달이 미약하고 기질의 밀도가 낮은 사립체 등이 관찰되었다. CAA군과 CAB군에서는 간세포의 뚜렷한 핵막과 고른 핵질, 발달된 cristae, 기질의 밀도가 높은 사립체, 발달된 층판 구조의 과립세포질세망이 관찰되었다. 이는 강황이 손상된 간세포에 세포보호 효과가 있으며 간세포내의 신생물 형성을 억제한 것으로 보인다.
이상의 실험결과를 요약하여 보면 실험군은 대조군에 비해 간 무게의 변화, 혈청지질의 변화, transaminase (AST, ALT)의 활성, α-fetoprotein(AFP)의 농도, 간조직의 광학현미경 관찰, 간세포의 전자현미경 관찰 결과 강황이 간암의 증식 억제와 면역 효과가 있다고 유추해 볼 수 있다. 그러나 정확한 직접 투여량과 투여기간에 대한 유의성은 아직 불명확하여 이에 대한 검증이 필요할 것으로 보이며, ALP와 LDH의 활성, SOD와 catalase의 활성, 체중변화에서 유의성이 명확하게 나타나지 않은 점은 더욱 깊은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
V. 결 론
강황추출물이 diethylnitrosamine과 CCl 4 로 유발된 흰쥐의 간암 형성과 간 손상에 미치는 영향을 확인하기 위해 간암과 간 손상을 유발시킨 후, 9주 동안 강황 추출물을 투여하여 200 ㎎/㎏(CAA군)과 400 ㎎/㎏ (CAB군)으로 나누어 투여한 후 각각의 효과를 조사한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
  • 1. 체중은 대조군이 정상군에 비하여 5주 까지는 감소하였으나 6주 이후부터는 정상군 보다 증가하였고, 실험군의 체중은 대조군에 비하여 모든 실험 기간 동안 증가하였다.
  • 2. 간의 중량 및 체중 100g당 간 중량은 정상군에 비하여 대조군과 실험군 모두 증가하였고, 대조군에 비해 실험군은 모두 감소하였으며, 특히 체중 100g당 간 중량에서는 CAB군이 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다.
  • 3. 혈청지질 중 triglyceride는 대조군에 비해 실험군에서 증가하였으나 유의성은 없었고, HDLCholesterol의 함량은 유의성 있게 증가하였다.
  • 4. Transaminase의 활성은 대조군에 비해 모든 실험군에서 감소하였으며 특히 CAB군에서는 유의성 있게 감소하였다.
  • 5. ALP와 LDH 활성은 대조군에 비해 모든 실험군에서 활성도가 감소하였으나 유의성은 없었다.
  • 6. AFP는 정상군에 비해 대조군이 유의성 있게 증가하였으며, 대조군에 비해 모든 실험군에서 유의성 있는 감소를 보였다.
  • 7. SOD의 활성도를 측정한 결과 정상군에 비해 대조군은 증가하였고 대조군에 비해 모든 실험군에서 감소하였으나 유의성은 없었다. Catalase의 활성도를 측정한 결과 정상군에 비해 대조군은 감소하였으며, 실험군은 정상군과 대조군에 비해 증가하였으나 유의성은 없었다.
  • 8. 간조직을 광학현미경으로 관찰한 결과 대조군에서는 조직 전반에 걸쳐 커다란 핵을 갖는 세포들과 암세포의 집단들이 다수 관찰되었으나, CAB군에서는 거의 관찰되지 않았다.
  • 9. 간세포를 전자현미경으로 관찰한 결과 대조군의 불규칙한 핵막, 응축된 핵질에 비해 실험군에서는 잘 보존된 세포핵과 고르게 발달된 핵질이 관찰되었다.
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