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Cytoprotective Effects of Artemisia princeps Extract through Inhibition of Mitochondrial Dysfunction
Cytoprotective Effects of Artemisia princeps Extract through Inhibition of Mitochondrial Dysfunction
Herbal Formula Science. 2013. Dec, 21(2): 63-71
Copyright © 2013, The Korean Academy of Oriental Medicine prescription
This paper is available at http//:www.ompak.okdanche.com which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
  • Received : October 21, 2013
  • Accepted : November 22, 2013
  • Published : December 30, 2013
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About the Authors
희윤 최
갈경환 제
영우 김
정우 이
수아 조
일제 조
sckim@dhu.ac.kr
상찬 김
sckim@dhu.ac.kr

Abstract
Objectives :
Artemisia princeps is used as moxa in moxibustion and traditional herbal medicine. And its extracts or compounds is known to have an efficacy of antioxidant, anti-diabete, anti-cancer, anti-inflammation and neuroprotection. This study was performed to investigate the cytoprotective effect of Artemisia princeps extract (APE) against arachidonic acid (AA)+iron-induced oxidative stress on HepG2 cell.
Methods :
The effects of APE on cell viability has been assessed using MTT assay. And flow cytometric analysis was performed to estimate APE's effects on mitochondrial function. To investigate its underlying mechanism, related protein was analysed by using immunoblot analysis.
Results :
Treatment of APE increased relative cell viability, prevented a decline of B-cell lymphoma-extra large (Bcl-xL) and cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) and procaspase-3, and also protected mitochondrial membrane permeability (MMP) against oxidative stress induced by AA+iron. In addition, APE treatment increased phosphorylation of AMP-activated protein kinase (AMPK) exerts a cytoprotective effect.
Conclusions :
This results demonstrate that APE has an ability to activation of AMPK which protects cells from AA+iron-induced oxidative stress and restores MMP.
Keywords
Ⅰ. 서 론
철은 인체대사에 필수적인 성분이나 장기조직 및 세포에 정상이상으로 축적되면 세포사멸, 조직손상 등을 일으킬 수 있는 양날의 검과 같은 존재이다. 혈철소증 (Hemosiderosis)은 이러한 철이 혈중에 과다하게 존재하여 결과적으로 hemodesirin이 축적되는 상태를 의미하는 의학용어로 지중해빈혈증 (thalassemia), 골수형성이상증후군 (myelodysplastic syndromes), 겸형적혈구빈혈증과 같이 만성적인 혈액손실이 동반되는 질환에서 장기간의 수혈이나 혈액투석의 결과로 발생하는 것이 일반적인 원인이다. 간은 철이 가장 많이 저장되는 곳으로 과다한 철의 축적에 의해 유도되는 산화적 스트레스는 간섬유화, 간경화증, 간세포암 등을 유발할 수 있다.
과도한 철의 축적에 대한 병리학적 기전은 (1) 철에 의해 촉매되는 자유라디칼 반응을 통한 지질의 과산화, (2) 간세포 활성화를 통한 콜라겐 형성 촉진, (3) 치명적인 세포의 손상과 간암을 유발하는 소인이 되는 반응성산소종 (Reactive oxygen species, ROS) 또는 철과 DNA의 상호작용이라고 알려져 있다 1) . 과도한 ROS는 인지질 막에서의 지방산의 산화를 촉진하고 이는 포스포리파아제 (phospholipase)를 활성화시키며 phospholipase는 활성화된 전염증유도물질인 아라키돈산 (arachidonic acid, AA)의 분비를 자극한다고 알려져 있으며 2) , AA로 인해 미토콘드리아에서 생성된 과도한 ROS는 세포자멸사 (Apoptosis)를 유도하는 것으로 알려져 있다 3,4) . 게다가 철의 촉매작용 하에서 AA에 의한 산화적 스트레스는 더욱 증폭되며, 미토콘드리아 장애와 세포 장애를 촉진시키는 것으로 연구된 바 있다 5) . 그러므로 AA와 철에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 항산화제의 개발은 혈철소증 환자의 치료에 상당한 도움을 줄 수 있을 것으로 사료 된다.
애엽(艾葉)은 국화과에 속하는 다년생 초목인 황해쑥 (Artemisia argyi Lev. et Vant.)의 잎 및 어린줄기를 말린 약재 (한국)를 말하며 6) , 애엽의 열수 추출물은 간조직 세포내 hydrogen peroxide (과산화수소) 생성 감소, NO 생성 감소를 통해 간 손상 완화 효과 7) , 애엽의 에탄올 및 메탄올 추출물 또한 free radical 소거능력 8) , 항염증, 항산화효과 9) 또한 보고된 바 있다. 그러나 아직까지 AA와 철에 의해 유도된 산화적 스트레스, 즉 간의 철 축적질환에 대한 애엽의 항산화효과 및 간세포 보호 작용에 대해서는 규명된 바가 없었다.
따라서 본 연구에서는 애엽의 항산화 효과에 중점을 두고, 사람의 간세포주 (HepG2 cell)에 AA와 철을 처리하여 산화적 스트레스를 유발하여 이에 대한 애엽 추출물 (Artemisia princeps Pamp. distilled water extract, APE)의 세포보호효과 및 이에 대한 작용기전을 규명하기 위한 실험을 실시하였다.
Ⅱ. 재료 및 방법
- 1. Materials
Artemisia princeps Pamp. 추출물 (APE)은 200g을 물 1.5L에 넣고 3시간 끓인 후 추출물을 거즈로 1차 여과하고, 0.2μm filter로 여과하였다. 이 여과액을 rotary evaporator로 농축하고, 이 농축액을 ultra- Low temperature freezer에 12시간동안 넣어 동결시켰다. 동결된 추출물을 동결건조기로 동결 건조하여 APE 89.62g을 얻었으며, 사용 때까지 –20℃에서 보관하였다. APE의 수율은 10.59%였으며 세포배양배지 (DMEM)에 녹여 사용하였다.
3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoleum bromide (MTT)는 Sigma-aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), Penicillin Streptomycin, Fetal bovine serum (FBS)는 GibcoBRL (Eggenstein, Germany)에서 구입하였다. Immunoblot analysis를 위한 p-AMPK, p-ACC, PARP, caspase-3의 항체와 anti-mouse, anti-rabbit Horseradish peroxidaselinked IgG 항체는 cell signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 AMPK, Bcl-xL, β-actin에 대한 항체는 Santa cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, flow cytometric analysis에 이용한 Rhodamine 123 CALBIOCHEM 은 Merck Millipore (Billerica, MA, USA)에서 구입하였다.
- 2. Cell culture and treatment
실험에 사용한 HepG2 cell은 사람의 간세포 유래의 세포주로 한국 세포주은행 (서울, 한국)에서 구입 하였으며, DMEM에 10% FBS, 100 U/ml penicillin 및 100 ㎍/㎖ streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO 2 조건의 incubator에서 배양하였다. 각각 실험과정에 맞는 plate에 세포를 적정농도로 분주하여 위의 배지에 12시간동안 배양한 다음, FBS를 포함하지 않는 배지로 교환하여 12시간 더 배양하였다. 실험과정의 모든 세포는 80~90%의 confluence에서 실험하였고, 20 passage를 넘기지 않은 세포만 사용하였다.
- 3. MTT assay
HepG2 cell을 48 well plate에 5×10 4 cells/well로 분주하여 배양하여 사용하였다. Fig. 1A 의 실험에서 는 APE를 각각 3, 10, 30, 100, 300 ㎍/㎖으로 처리 한 다음 16시간 동안 배양하였고, Fig. 1B 의 실험에 서는 APE를 각각 3, 10, 30, 100 ㎍/㎖의 농도로 AA 10μM 과 함께 처치하고 12시간 후에 iron 5μM을 4시간 동안 처치하였다. 이 후 MTT solution을 2 ㎍/ ㎖로 처리한 후 2시간 더 배양한 다음 MTT solution 을 제거하고 생성된 formazan crystal을 DMSO에 녹여 Tecan Infinite M200 PRO microplate reader로 570mm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 control cell에 대한 백분율로 나타내었다.[i.e. cell viability(% control) = 100 ×/(absorbance of treated sample)/ (absorbance of control)]
- 4. Measurement of ROS production
APE의 ROS 소거활성을 측정하기 위하여 HepG2 cell 을 이용하여 DCFH-DA assay를 실시하였다. HepG2 cell을 48 well plate에 5×10 4 cells/well로 분주하여 배양하였다. APE 100㎍/㎖와 AA 10μM을 동시에 처치하고 12시간 뒤 iron 5μM을 2시간 동안 처치하였다. ROS의 양을 측정하기 위하여 10μM DCFH-DA 시약을 샘플 수확 전 30분간 배양하고 fluorecence microplate reader (Tecan Infinite M200 PRO)를 사용하여 형광강도 excitation 485nm, emission 535nm로 측정 하였다.
- 5. Immunoblot analysis
6 well plate에 10 6 cells/well로 분주하여 실험에 사용하였다. APE 100㎍/㎖와 AA 10μM을 동시에 처치 하고 12시간 뒤 iron 5μM을 2시간 동안 처치하였다. 20 mM Tris CI (pH7.5), 1% Triton X-100, 137 mM sodium chloride, 10% glycerol, 2mM EDTA, 1mM sodium orthovanadate, 25mM b-glycerophosphate, 2mM sodium pyrophosphate, 1mM phenylmethylsulfonylfluoride와 1 mg/ml leupeptin을 함유하는 buffer를 사용하여 세포를 용해시켜, 15,000×g로 30분간 원심 분리하여 단백질을 추출하고, BCA protein assay kit를 이용하여 정량하였다. 단백질은 SDS-PAGE를 이용하여 크기별로 분리한 후 acrylamide gel로부터 nitrocellulose membrane으로 Electrotransfer시켰다. 이후 nitrocellulose membrane을 각각의 단백질에 맞는 항체를 사용하여 4℃에서 overnight 처리하였다. secondary antibody는 HRP-linked anti rabbit 혹은 anti-mouse를 사용하였으며, ECL chemilu minescence detection reagents를 이용하여 발색한 후 Image analyzing system을 사용하여 관찰하였다.
- 5. Flow cytometric analysis
6 well plate에 10 6 cells/well로 분주하여 실험에 사용하였다. APE 100㎍/㎖와 AA 10μM을 동시에 처치하고 12시간 뒤 iron 5μM을 1시간 동안 처치하였다. 세포에 막 투과성 형광염색용액인 Rhodamine 123을 0.05μg/ml의 농도로 처리하고 은박지로 빛을 차단한 후 1시간 동안 염색하고, Trypsin 용액을 처리하여 세포를 회수하였다. 이를 1% FBS가 함유된 Phosphate buffered saline으로 세척한 후, Flow cytometer로 MMP (mitochondrial membrane potential, 미토콘드리아 막전위)의 변화를 측정하였다.
- 6. Statistical analyses
실험 결과는 mean ± S.D.로 나타내었으며, t-test의 통계처리방법으로 통계적 유의성을 검정하였다.
Ⅲ. 결 과
- 1. The effects of APE on HepG2 cell viability
APE가 세포생존율에 미치는 영향을 평가하기 위해 MTT assay를 실시하였다. Tetrazolium-based colorimetric (MTT) assay는 대사과정이 온전한 세포의 미토콘드리아 내에 탈수소 효소가 수용성인 노란색의 tetrazolium salt [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide] (MTT, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 자주색을 띄는 비수용성의 MTT formazan 결정으로 환원시키는 원리를 이용한 것으로, 이 formazan을 dimethyl sulfoxide (DMSO)로 녹인 후에 570nm 의 파장에서 흡광도를 측정하는 것으로, 그 값이 높을수록 대사적으로 왕성한 세포 즉, 살아있는 세포의 농도를 반영하게 된다. 본 연구에서는 대조군 (Control)의 흡광도 값과 각 처치군의 흡광도 값을 비교함으로써 상대적인 세포생존율을 비 교, 평가하였다.
APE의 처지 자체가 세포생존율에 미치는 영향을 평가하기 위해 APE를 3, 10, 30, 100, 300 ㎍/㎖의 농도로 처치한 결과, 대조군과 비교하였을 때 각 처치군이 통계적으로 유의한 차이가 없음을 확인하였다 ( Fig. 1A ). 이와 같은 결과로 볼 때 APE가 주어진 농도에서는 세포독성을 나타내지 않는다는 것을 알 수 있다.
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The effects of Artemisia princeps Pamp extract (APE) on hepatocyte viability. (A) To estimate the effect of APE on hepatocyte viability, MTT assay has been performed. HepG2 cells were treated with APE (3, 10, 30, 100, 300 ㎍/㎖) for 16h. There is no significant differences compared control group with each APE-treated group.(B) The hepatoprotective effects of APE on AA+iron-induced cytotoxicity. HepG2 cells were treated with APE (3, 10, 30, 100 ㎍/㎖) and 10 μM AA for 12h. and then cells were exposed to 5 μM iron for 4h. Cell viability was measured by using MTT assay. Statistical significance of differences denotes by next following;**p < 0.01: AA+iron alone vs. control, ##p < 0.01: APE-treated groups vs. AA+iron alone. Data represent the mean ± S.E.M.
APE가 AA+iron로 유도된 산화 스트레스를 주었을때 세포생존율에 미치는 영향을 MTT assay로 평가한 결과, AA+iron만을 처치한 실험군의 경우, 대조군 (100%)과 비교하였을 때 평균 27.71%의 세포생존율을 나타 내어 통계적으로 유의한 차이가 있었다. 이로 보아 AA+ iron로 유도된 산화 스트레스가 세포독성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었으며, APE를 AA+iron과 함께 처치한 실험군에서는 APE가 농도 의존적으로 세포생존율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 10, 30, 100 ㎍/㎖의 농도에서는 AA+iron을 단독으로 처치한 실험군의 세포생존율과 비교하였을 때 통계적으로 유의한 증가를 보여주었다 ( Fig. 1B ).
- 2. The effects of APE on protein related with apoptosis.
AA+iron으로 유도된 산화 스트레스가 세포 자멸사 (apoptosis)를 일으킨다는 사실은 여러 연구를 통해 수차례 확인된 바 있다 10,11) . 따라서 본 연구에서는 apoptosis와 관련된 지표단백질들을 immunoblot analysis를 통해 그 발현을 관찰하였다. 그 결과 AA+iron을 처치한 실험군에서는 procaspase-3, uncleavaged poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)와 anti-apoptosis인자인 B-cell lymphoma-extra large (Bcl-xL)의 발현 정도가 대조군에 비해 감소한 것을 관찰할 수 있었으며, APE의 처치로 그 감소가 반전되는 것을 확인하였다. 이외에 APE를 단독으로 처치하였을 때는 지표단백질의 발현 감소는 관찰되지 않았다 ( Fig. 2 ).
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The effects of APE on apoptotic marker proteins. Immunoblot analyses were performed on the lysates of HepG2 cells that had been treated with APE (100 ㎍/㎖) and 10 μM AA for 12h and then exposed to 5 μM iron for 2h. Immunoblot of β-actin was verified for equal loading of proteins.
- 3. Cellular antioxidant effect of APE
AA+iron에 의한 산화적 스트레스는 세포내의 활성 산소종이 생산되는데 과도하게 발생할 경우 미토콘드리아막의 산화장애를 유발하여 세포사멸에 중요한 역 할을 한다 12). 세포 내 ROS의 생산 범위를 DCFH-DA 염색하여 Fluorecence microplate reader로 평가하였다. AA+iron을 처치 한 실험군의 경우 전체 세포 중 H 2 O 2 생성이 대조군과 비교해 2.3배의 큰 차이를 보였고, APE와 AA+iron을 함께 처리한 실험군의 경우에도 -0.9배 큰 차이를 보였다 ( Fig. 3 ). 이는 in vitro 항산화 효과 실험을 토대로 APE의 항산화 활성을 확인한 결과이다.
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The cellular antioxidant effect of APE. (A) Cellular H2O2 Production was monitored by measuring DCF fluorescence. HepG2 cells were treated with APE (100 ㎍/㎖) and 10 μM AA for 12h, followed by incubation with 5 μM iron for 1h. The cell were harvested after DCFH-DA staining. Statistical significance of differences denotes by next following;**p < 0.01: AA+iron alone vs. control, ##p < 0.01: APE-treated groups vs. AA+iron alone. Data represent the mean ± S.E.M.
- 4. Inhibition effects of APE to mitochondrial dysfunction by APE
AA+iron에 의한 산화적 스트레스로 유도되는 apoptosis는 미토콘드리아 막전위의 파괴에 의한 미토콘드리아 막투과성 (Mitochondrial membrane permeability)의 증가로 인해 발생하는 것으로 알려져 있다 13) . APE가 AA+iron에 의한 미토콘드리아 기능이상을 억제할 수 있는지 알아보기 위해 flow cytometric analysis를 수행하였다. Rhodamine 123 (Rh123)은 미토콘드리아 막전위에 의해 막에 부착되어 미토콘드리아의 막전위가 유지되는지 확인해볼 수 있게 해주는 형광염색시약이다 ( Fig. 4A ). RN1 fraction은 Rh123의 부착정도가 낮은 분획으로 이 분획의 세포 수는 미토콘드리아의 기능 이상 즉, 미토콘드리아의 막전위가 파괴된 정도를 반영하게 된다. AA+iron만을 처치한 실험군의 경우 전체 세포 중 RN1 fraction의 비율이 61.39%나 차지해 대조군 (4.21%)과 비교해 큰 차이를 보였으며 APE와 AA+iron을 함께 처리한 실험군 (3.07%)의 경우와도 큰 차이를 보였다 ( Fig. 4B ). 이와 같은 결과로 볼때, APE가 AA+iron로 인한 미토콘드리아 기능이상을 억제한다는 사실을 알 수 있다.
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The inhibition effects of APE on mitochondrial dysfunction. (A) Mitochondrial membrane permeability (MMP) was investigated by using flow cytometry. HepG2 cells were treated with APE (100 ㎍/㎖) and 10 μM AA for 12h, followed by incubation with 5 μM iron for 1h. The cell were harvested after Rhodamine 123 staining.(B) AA+iron treatment increased the subpopulation of RN1 fraction (low Rh123 fluorescence), as indicated by the left shift of population. Statistical significance of differences denotes by next following;**p < 0.01: AA+iron alone vs. control, ##p < 0.01: APE-treated groups vs. AA+iron alone. Data represent the mean ± S.E.M.
- 5. AMPK activation by APE.
AA+iron에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 APE의 세포 보호능의 작용 기전을 규명하기 위한 실험으로 immunoblot analysis를 수행하였다. APE를 일정한 시간에 따라 처리한 결과 phospho-AMP-activated protein kinase (p-AMPK)의 발현을 관찰할 수 있으며, AMPK의 활성이 3시간정도 유지됨을 확인할 수 있었다. 또한 AMPK의 하위인자인 Acetyl-CoA Carboxylase (ACC)의 인산화 역시 관찰할 수 있었다 ( Fig. 5 ).
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AMPK activation by APE. (A) Immunoblot analyses were performed on the lysates of HepG2 cells that had been treated with APE (100 ㎍/㎖) for the indicated time period.(B) Increase in p-ACC phosphorylation. Immunoblotting for p-ACC, HepG2 cells that had been treated had been incubated with APE (100 ㎍/㎖) for 1h, continuously treated with 10μM AA for 12h, and then exposed to 5μM iron for 2h. Equal protein loading was verified by β-actin immunoblotting. Result were confirmed by repeated experiments. The statistical significance of differences between treatments and either the vehicletreated control (**p < 0.01) or cells treated with AA+iron (##p < 0.01) was determined.
Ⅳ. 고 찰
애엽(艾葉)은 국화과의 황해쑥( Artemisia argyi Lev. et Vant.), 쑥( A. princeps Pamp. var. orientlis Hara) 또는 산쑥( A. montana Pamp.)의 잎 및 어린줄기를 말린 약재(한국)를 말하며 한의학적 효능으로는 온경지혈 (溫經止血), 산한지통(散寒止痛), 조경안태(調經安胎) 및 제습지양(除濕止痒)이다 6) . 그리고 쑥의 sesquiterpene과 cineol 성분은 항산화작용을 통해 흡연으로 인해 생긴 유해 라디칼의 분해 촉진, 항산화 효소의 활성을 증가시킴으로써 폐의 정상적인 기능에 도움을 주는 것으로 연구된 바 있다 9) . 본 연구에서 AA와 철의 처치에 의해 유발된 산화적 스트레스에 대한 APE의 세포 보호능을 MTT assay를 통해 확인한 결과 APE가 통계적으로 유의하게 cell viability를 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 APE를 단독으로 처치한 MTT assay 에서는 대조군과 비교하였을 때 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았으므로 실험에 사용한 농도에서는 APE 의 세포독성을 배제할 수 있다.
산화적 스트레스에 의한 미토콘드리아 막전위의 파괴는 미토콘드리아 막의 투과성 (Mitochondial membrane permeability)을 증가시켜 막공 (membrane pore)을 통해 cytochrome C와 같은 pro-apoptotic mediator들을 세포질로 분비되게 한다 13) . 이로 인해 여러 apoptosis 관련 인자 및 단백질들 (caspase 등)이 활성화되면 세포자멸사가 유도 된다 14,15) . Caspase는 세포사멸 관련 신호전달물질로 caspase는 세포 내에서 불활성화 형태인 procaspase의 상태로 존재하다가 ROS와 같은 자극에 의해 활성화 된 cytochorme C에 의해 분해되면서 활성화 된다 16) . 여러 caspase family 중에서 caspase-3는 caspase-8과 caspace-9의 신호를 증폭시켜 최종적으로 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다 17) . 또한 caspase-3에 대한 연구 중에서 이 단백질이 세포사멸 과정에서 PARP를 분해한다는 것이 알려져 있는데 18) , PARP는 세포 증식, DNA 재조합, 염색체의 안정화에 중요한 역할을 하는 단백질로, 세포의 핵에서 관찰할 수 있다. PARP의 주요한 역할은 단일가닥 DNA의 손상을 인지하고 DNA ligase3에게 DNA의 원상복구를 위한 신호를 보내는 것이다. caspase가 PARP를 분해함으로써 PARP는 비활성화 되고, 이것은 일반적으로 DNA의 손상이 지속되는 결과의 이유로써 알려져 있다. 이런 경우 세포수준에서는 DNA 복구에 에너지를 쏟는 것 보다 세포의 자멸사가 유도된다고 알려져 있다 19,20) . 또한 Bcl-xL은 apoptosis 방어인자 중 하나로 미토콘드리아 외막을 보전하는데 기여하는 인자이다 13) . 본 연구에서는 apoptosis 관련 표지단백질인 procaspase-3 와 PARP의 발현을 immunoblot analysis를 통해 관찰한 결과, AA+iron만을 처리한 실험군에서 대조군에 비해 procaspase-3와 이의 하위인자인 PARP가 감소하는 것을 관찰하였으며, APE의 처치가 이를 반전시킨다는 사실 또한 확인할 수 있었다.
정상 간 조직에서의 간세포는 효소적, 비효소적인 항산화 과정을 통해 산화력을 가진 분자를 없애거나 중화시킴으로써 안정적으로 세포 내의 ROS 수준을 유지할 수 있다. 그러나 세포의 정상적인 방어기능 이상의 ROS 축적은 세포 자멸사 및 세포 손상을 유발시킨다. 식이로 섭취된 철분은 장 세포에 의해 흡수되어 ferritin에 부착되어 저장되거나 transferrin과 결합하여 혈장으로 배출되며, 주로 간세포에 저장된다. 간세포에서 철은 팬톤 반응 (Fenton reaction)으로 알려진 화학반응을 통해 ROS, superoxide (O2-), hydrogen peroxide (H 2 O 2 )로부터 hydroxyl radical (OH-)을 생성하는 과정을 촉매 한다. 이렇게 생성된 hydroxyl radical은 지질과산화, 세포내 단백질을 손상시켜 결국 세포의 사멸을 촉진시키게 된다. 또한 철 촉매 하에서의 AA는 미토콘드리아 내의 superoxide 생성을 증가시키며 ROS 또한 증가시켜, 결과적으로 산화적 스트레스와 세포 손상은 더욱더 촉진 된다 11) . 세포 내 ROS의 생산 범위를 DCFH-DA 염색하여 Fluorecence microplate reader로 측정한 결과, AA+iron의 처치로 인해 ROS생성 증가를 확인하였고, APE와 AA+iron을 함께 처리한 실험군의 경우에는 ROS의 생성을 억제하는 것을 확인하였다.
Flow cytometric analysis를 이용하여 AA+iron의 처치로 인해 미토콘드리아의 막전위가 파괴되는 것을 관찰할 수 있으며, APE의 처치가 이러한 막전위의 파괴를 방어한다는 사실 또한 확인할 수 있다. 또한 위와 같은 실험결과로 미루어 볼 때 AA+iron에 의해 유도된 산화적 스트레스가 미토콘드리아의 막전위를 파괴하여 막투과성을 비정상적으로 증가시키며 세포의 apoptosis를 유발한다는 사실을 알 수 있다 21) . 또한 APE가 이를 억제함을 확인하였다. AMPK는 세포내부의 에너지 준위의 감지물질로 산화적 스트레스, 저산소증의 병리학적 상황에서 세포생존과 자살을 조절하는 것으로 알려져 있으며, AMPK의 활성화는 cytochorome C의 분비를 막아 caspase-3의 활성을 억제하여 미토콘드리아 막의 보호에 관여하는 것으로 알려져 있다 22) . AA+iron에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 APE의 세포 보호능의 작용 기전을 규명하기 위한 실험으로 immunoblot analysis를 수행하였다. APE를 일정한 시간에 따라 처리한 결과 인산화 된 AMPK의 발현을 관찰할 수 있으며, AMPK의 활성이 3시간정도 유지됨을 확인할 수 있었다. 또한 AMPK 의 하위인자인 ACC의 인산화 역시 관찰할 수 있었다.
본 연구에서는 APE가 AA+iron에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대해 AMPK를 활성화 하고 미토콘드리아의 막을 보호하여 apoptosis의 유발을 억제함으로써 세포보호효과가 있다는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 이러한 APE의 세포보호효과에 대한 분자 생물학적인 정확한 작용기전을 규명하기 위해서는 후속 연구가 뒷받침되어야 할 것으로 사료된다.
Ⅳ. 결 론
본 연구에서는 애엽 추출물 (APE)의 항산화효과를 평가하기 위하여, HepG2 세포를 AA와 iron을 처리하여 산화적 스트레스를 유도 된 세포 생존률과 apoptosis 관련 인자 발현, 미토콘드리아 막전위의 기능, 세포 보호능의 작용 기전을 위한, phospho-Acetyl- CoA Carboxylase (p-ACC), phospho-AMP-activated protein kinase (p-AMPK)의 발현 등에 미치는 영향을 측정하여 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
1 . APE를 HepG2 cell의 3, 10, 30, 100, 300 ㎍/㎖의 농도로 16시간 동안 배양한 후 MTT assay를 수행한 결과 모든 농도에서 유의하게 독성이 없는 것으로 나타났고, APE를 각각 3, 10, 30, 100, 300 ㎍/㎖의 농도로 AA 10μM 처치하고 12시간뒤 iron 5μM을 4시간 동안 처치 후 농도 의존적으로 세포 생존율을 증가시키는 것으로 나타났다.
2. AA+iron로 산화적 스트레스를 12시간 유도하였을때 apoptosis와 관련 된 지표단백질인 procaspase-3, PARP와 Bcl-xL의 발현을 감소 시켰다. APE 100 ㎍/㎖ 처치 시 그것을 억제시켰다. AA와 iron에 의한 산화 스트레스로 유도되는 apoptosis는 미토콘드리아 기능장애를 APE 처치 시 보호하였다.
3. APE는 HepG2 cell과 0, 10’, 30’, 1, 3, 6h의 배양에서 p-AMPK, p-ACC의 발현이 3시간까지 활성화하는 것을 확인하였고, AA+iron에 의한 산화 스트레스를 유도된 HepG2 cell은 p-ACC의 인산화를 감소시키고, APE 처치 시 인산화 감소를 방어시켰다.
Acknowledgements
이 논문은 2012년도 정부(미래창조과학부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임 (No.2012-0009400)
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Browning JD , Horton JD 2004 Molecular mediators of hepatic steatosis and liver injury J Clin Invest 114 (2) 147 - 52    DOI : 10.1172/JCI200422422
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