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Effect of Prunellae Spica on Oxidative Stress and Mitochondrial Dysfunction in the Hepatocyte
Effect of Prunellae Spica on Oxidative Stress and Mitochondrial Dysfunction in the Hepatocyte
Journal of Physiology & Pathology in Korean Medicine. 2016. Feb, 30(1): 20-26
Copyright © 2016, The Korean Association of Oriental Medical Physiology
  • Received : October 02, 2015
  • Accepted : December 23, 2015
  • Published : February 25, 2016
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미희 장
혜림 서
상찬 김
sckim@dhu.ac.kr
영우 김
sckim@dhu.ac.kr

Abstract
Prunellae Spica , the herbaceous plant in the genus Prunella, is a traditional herbal medicine and has been reported to have diuretic, anti-bacterial and anti-oxidant effects. However, the mechanism of its action was not clearly identified. In the present study, we investigated the hepatoprotective effect of Prunellae Spica extract (PSE) against the damage of mitochondria and death in hepatocyte induced by oxidative stress. Treatment of arachidonic acid (AA)+iron significantly induced oxidative stress and apoptosis in the hepatocytes. However, PSE protected cells and inhibited apoptosis by altering the protein levels such as poly(ADP-ribose) polymerase and pro-caspase 3. Moreover, AA+iron induced reactive oxygen species production and mitochondrial dysfunction, and Both of them were inhibited by PSE treatment. PSE markedly activated AMP-activated protein kinase (AMPK), an important regulator in cell survival. Furthermore, this activation by PSE was mediated with liver kinase B1, a major upstream kinase that phosphorylates Thr 172 of AMPKα, and this activation was associated with its cell protection, as assessed by an experiment of a chemical inhibitor. In conclusion, this study demonstrate that PSE protects hepatocytes against oxidative stress as mediated with activation of LKB1-dependent AMPK pathway.
Keywords
서 론
산소를 이용하는 생명체는 에너지를 생산하는 과정에서 hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), superoxide radical (O 2 - ·), hydroxyl radical (OH·)등과 같은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성되고 1) , 생체 내에 존재하는 자기방어기구인 항산화 시스템(anti-oxidant system)에 의해 ROS가 제거되어 세포내 항상성을 유지한다. 2 , 3) 이러한 생체내 항산화 시스템에는 항산화 효소인 superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase 등과 비효소 항산화 물질인 glutathione (GSH), ascorbic acid, α-tocopherol, carotenoids 등이 있다. 4) 물리·화학적 요인이나 생체 내 대사과정의 불균형으로 인하여 세포내 항상성이 깨지면, ROS가 과도하게 생성되어 산화적 스트레스(oxidative stress)를 유발하고, 생체막 내 인지질의 변성 및 세포나 조직의 손상을 야기한다. 5) 이러한 세포 및 조직의 산화적 손상은 암의 발생과 전이에도 관여하고, 치매, 파킨슨병과 같은 퇴행성 신경 질환, 간질환, 그리고 당뇨병 등과 같은 질환들을 일으키게 된다. 이에 효과가 좋으면서 안전한 식물기원의 천연 항산화제 개발 연구가 많이 진행되고 있으며, 노화, 심혈관 질환, 암과 같은 종양질환 등의 치료에 대한 연구결과도 보고되고 있다. 6 , 7)
간은 물질대사가 왕성하게 이루어지는 가장 중요한 장기 중 하나이며, 간세포 소기관인 미토콘드리아(mitochondria)는 외부에서 섭취된 영양소들을 분해하여 생체가 필요로 하는 물질들의 구성단위를 생성하고, 대사에 필요한 에너지를 생성하여 제공한다. 미토콘드리아 내막에 존재하는 전자전달계는 ROS의 주요 생성 장소이며, 과도하게 생성된 ROS가 세포막의 불포화지방산과 결합하여 지질과산화를 유발하는 것이 간세포의 산화적 손상 기전 중 가장 잘 알려져 있다. 특히, 산화적 스트레스로 유발된 간세포 및 미토콘드리아 손상은 염증, 섬유화, 경화, 암 등의 간질환 발생 및 진행에도 관여한다. 4 , 8 , 9) 또한 간은 인체대사에 필수성분인 철이 많이 저장되는 곳으로 과도한 철 축적은 철 촉매-자유라디칼 반응으로 지질 과산화를 촉진하고, phospholipase A2를 활성화시켜 전염증성 매개체인 arachidonic acid (AA)의 분비를 자극, 간 실질세포에서는 산화적 스트레스, 대식세포에서는 염증을 유발한다. 10 - 12) 또한, AA가 지방산의 산화와 세포의 신호전달과 phospholipases 활성을 촉진시키는 과정에서 생성한 많은 ROS는 미토콘드리아의 막 투과 비정상을 유도하여 미토콘드리아 내막의 팽창과 막전위 붕괴 및 cytochrome c, apoptosis inducing factor 같은 apoptosis 관련 분자들을 cytosol로 방출시켜 apoptosis 를 유발한다. 12 - 16) 따라서, AA와 iron은 간세포 손상 기전 연구에서 산화적 스트레스 유도 물질로 이용될 수 있다.
하고초(夏枯草, Prunellae Spica )는 꿀풀과(Labiatae)에 속하고 한의학에서는 청간, 이뇨, 소염, 해열, 혈압강하 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 효능 연구로 항알레르기 및 항산화 작용이 보고되어 있다. 17 - 20) 하지만, 이의 분자기전에 대한 연구가 부족한 실정이다. 그러므로, 본 연구에서는 간 실질세포주인 HepG2 cell에 AA와 iron을 처리하여 간세포 손상을 유도한 후, 하고초 물추출물( Prunellae Spica extract, PSE)의 간세포 보호 및 항산화 효과를 평가하고 관련 분자기전 연구를 진행하였다.
재료 및 방법
- 1. 시약
Anti-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), anti-procaspase 3, anti-phospho acetyl-CoA carboxylase (p-ACC), anti-phospho AMP-activated protein kinase (p-AMPK), anti-phospho liver kinase B1 (p-LKB1), horseradish per-oxidase-conjugated goat anti-mouse IgG는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA)에서 구입하였고, horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG는 Thermo (Rockford, IL, USA)에서 구입하여 사용하였다. Arachidonic acid (AA), rhodamine123 (Rho123)은 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 그 외 2',7'-dichlorodihydrofluorescin diacetate (H2DCF-DA), ferric nitrilotriacetic acid (Fe-NTA), anti-β-actin 항체 등 다른 시약들은 Sigma (St. Louis, MO)에서 구입하였다.
- 2. 하고초 물추출물(PSE)의 제조
하고초는 대원약업사(Daegu, Korea)에서 구입하였고, 약재 100 g을 물 1 L에 넣고 100℃에서 3시간 동안 가열하였다. 전탕액을 filter paper (Toyo Roshi Kaisha Ltd, Tokyo, Japan)로 여과한 후, 감압농축하고, 동결건조(LABCONCO, USA)하여 분말화 하였다. 수율은 10.8 %였으며, 물에 녹여 0.22 μm filter (Millipore, USA)로 여과한 다음, 실험에 사용하였다.
- 3. 세포배양 및 처리
실험에 사용한 인체 유래 간 실질세포주인 HepG2 cell은 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)에서 구입하였으며, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS)과 100 units/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin을 첨가하였고, 37℃, 5% CO 2 의 incubator에서 배양하였다. 또한, serum free DMEM으로 교체하여 12시간 serum-starvation 후, 10~300 µg/mL 농도의 PSE와 10 µM AA를 12시간 동시 처리한 후, 5 µM iron을 1~4시간 처리하였다.
- 4. 세포 생존율 검사 (MTT assay)
HepG2 cell을 24 well plate에 2×10 5 cells/well로 분주하여 24시간 배양하였다. 0, 1, 3, 10, 30, 100 µg/mL의 PSE와 10 µM AA를 12시간 처리한 후, 5 µM iron을 1시간 더 처리하였다. 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시약을 0.1 mg/mL로 처리하고 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 생성된 formazan crystal을 dimethylsulfoxide로 용해시켰으며. microplate 측정기(Tecan Infinite M200 PRO, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 5. Immunoblot analysis
HepG2 cells을 6 well plate에 배양한 후, PSE 100 μg/mL과 AA 10 μM을 12시간 처리한 후, iron 5 μM을 2시간 더 처리한 후, 이전 연구방법과 같은 방법으로 분석을 실시하였다. 5 , 12) 자세하게는 다음과 같은데, phosphate buffered saline (PBS)로 2회 washing 후, lysis buffer (Thermo, Rockford, IL, USA)를 첨가하여, 세포를 모아 sonicator (Sonics, USA)로 세포를 균질화하였다. 15,000 xg 에서, 30분간 원심분리한 후, 상층액만 취하여 bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 단백질을 정량하였다. 그런 후, 세포에서 추출한 단백질을 10% SDS-PAGE로 전기영동하여 enhanced chemiluminoscent system (Amersham, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 image analyzing system (Ultra-Violet Products Ltd., Upland, CA, USA), 또는 X-ray 필름에 감광하였고, Image J 1.42 software (NIH Bethesda, USA)를 이용하여 정량하였다.
- 6. 세포 내 ROS 측정
PSE의 세포 내 항산화능을 측정하기 위하여 H2DCF-DA 실험법을 이용하여 이전 연구와 같은 방법으로 분석하였다. 5 , 12) HepG2세포를 10 µM H2DCF-DA로 30분 동안 37℃에서 세포 반응을 유도하였고, fluorescence microplate reader (Tecan Infinite M200 PRO)를 이용하여 excitation 485 nm과 emission 535 nm 파장에서 측정하였다.
- 7. Mitochondrial membrane permeability (MMP) 측정
PSE의 미토콘드리아 보호효과를 관찰하기 위하여 MMP는 이전 연구와 같은 방법으로 측정하였다. 5 , 12) 막 투과성 형광 dye인 rhodamine123 (Rho123, 0.05 µg/mL)으로 30분간 염색한 후, trypsin을 처리하여 세포를 모은 후, PBS에 재부유하여 flow cytometer (FACS, Partec, Münster, Germany)로 MMP의 변화를 측정하였다. 각 20,000개 의 세포를 분석하였다.
- 8. 통계처리
본 연구의 실험 결과는 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값±표준 편차(mean±S.D.)로 표시하였다. 각 처리군의 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA) 방법을 이용하였고, Student’s t-test를 사용하여 통계적 유의성을 검증하였다(p<0.05 또는 p<0.01).
결 과
- 1. 세포생존과 apoptosis
PSE의 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 이용하였다. PSE의 농도를 각각 1, 3, 10, 30, 100 µg/mL로 24시간 처리한 결과, 세포 독성을 나타내지 않았다. 다음으로 PSE의 산화적 스트레스에 대한 간세포 보호 효과를 평가하였다( Fig. 1 A). 다양한 농도의 PSE와 10 µM의 AA를 12시간 동안 동시 처리하고, 5 µM iron을 4시간 더 처리한 결과, AA+iron 단독 처리군은 대조군인 정상세포에 비해 세포 생존율이 21.9%로 현저한 감소를 보였다( Fig 1 A). 반면, PSE 처리군은 농도 의존적으로 세포생존율이 증가했으며, AA+iron 처리군과 비교하였을 때, PSE 1~100 µg/mL의 모든 농도에서 통계적으로 유의한 증가를 보였다 ( p <0.01). 특히 30 μg/mL에서 대조군과 거의 비슷한 정도까지 세포 손상을 방어하는 것으로 나타났으므로, 이후 실험에서는 PSE 30 μg/mL의 농도를 사용하였다( Fig. 1 A). Apoptosis에 대한 PSE의 효과를 알아보기 위하여 apoptosis와 관련된 단백질의 발현 양상을 immunoblot 분석법으로 확인하였다. HepG2 cell에 AA+iron 처리 시, pro-caspase 3와 PARP 단백질의 발현이 감소하였고, PSE의 처리가 이 단백질들의 발현 변화를 정상화시켰다( Fig. 1 C).
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Inhibition of AA+iron-induced cell death and apoptosis by PSE. Effects of PSE on cell proliferation (A) and viability (B) were assessed using MTT assays. HepG2 cells were treated with PSE (1, 3, 10, 30, 100 μg/mL) and 10 μM AA for 12h, followed by exposure to 5 μM iron for an additional 4 h. Results were confirmed by repeated experiments. Data represents the mean ± S.D. from separate experiments. The statistical significance of differences between treatments and either the vehicle-treated control (##p<0.01) or cells treated with AA+iron (**p<0.01) was determined. (C) Effects of PSE on protein levels related with apoptosis. Immunoblot analysis was performed on the lysates of HepG2 cells that had been simultaneously treated with 30 μg/mL PSE and 10 μM AA for 12h, and then exposed to 5 μM iron for 2h. Equal loading of proteins was verified by β-actin immunoblotting.
- 2. 항산화 효과
세포 내 과도한 ROS 생성 및 축적은 대표적 항산화물질인 GSH의 결핍을 통하여 apoptosis를 유도하므로, 산화적 손상의 좋은 지표이다. 21 , 22) PSE의 세포 내 항산화 활성을 측정하기 위하여, HepG2 cell에 AA+iron을 처리하여 산화적 스트레스를 유도한 후, H 2 O 2 의 농도를 측정하였다. 이 때 H 2 O 2 의 농도는 H 2 DCF-DA가 세포 내 생성된 H 2 O 2 와 반응하여 형광물질인 2’,7’-dichlorofluorescin (DCF)로 산화되는 원리를 이용하여 microplate reader기를 이용하여 측정하였다.
실험결과, AA+iron는 HepG2 cell에서 H 2 O 2 의 생성을 2배 증가시킨 반면(p<0.01), PSE 처리군은 AA+iron에 의한 H 2 O 2 생성을 유의하게 감소시켰다(p<0.01, Fig. 2 ).
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Antioxidant effect of PSE. ROS production. H2O2 production was monitored by measuring intensity of DCF fluorescence in cells that had been treated as described in the legend to Fig. 1B. Data represents the mean±S.D. from separate experiments. The statistical significance of differences between treatments and either the vehicle-treated control (##p<0.01) or cells treated with AA+iron (**p<0.01) was determined.
- 3. Mitochondrial dysfunction 저해 효과
AA+iron 유도 산화적 스트레스는 미토콘드리아 막전위(mitochondria membrane potential) 감소와 미토콘드리아 막투과성(mitochondria membrane permeability) 증가 및 apoptosis를 유도한다. 4 , 12 , 23) PSE의 미토콘드리아 보호 효과를 알아보기 위하여, HepG2 cell을 Rho123으로 염색한 후 flow cytometry로 형광강도를 측정하였다. AA+iron는 RN1 fraction(파괴된 미토콘드리아 막전위 세포 숫자)을 증가시킨 반면, PSE의 처리는 AA+iron에 의해 증가된 RN1 fraction을 통계적으로 유의한 수준으로 감소시켰다(p<0.01, Fig. 3 A~B). 이 결과는, PSE가 산화적 스트레스로 인한 mitochondrial dysfunction을 억제한다는 것을 나타낸다.
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Protection of mitochondria. (A) Mitochondrial membrane permeability (MMP). HepG2 cells were treated as described in the legend to Fig. 1B. After treatment, cells were stained with Rho123 and measured fluorescence intensity using FACS. Treatment of cells with AA+iron increased the subpopulation of RN1 fraction (low Rho123 fluorescence). (B) Relative % of RN1 fraction. Data represent the mean±S.D. from three separate experiments. The statistical significance of differences between treatments and either the vehicle-treated control (##p<0.01) or cells treated with AA+iron (**p<0.01) was determined.
- 4. AMPK 활성화
AA+iron에 의해 유도된 apoptosis의 보호기전으로 AMPK pathway의 활성화를 제시한 연구가 있고, 활성화된 AMPK는 인산화를 통하여 세포 내 다양한 효소를 조절한다고 알려져 있다. 4 , 12) 본 연구에서도 PSE 세포 보호의 분자기전으로서 AMPK pathway가 매개되는지 여부를 규명하고자 하였다. HepG2 cell에 30 μg/mL PSE를 시간 의존적으로 10분에서 6시간까지 처리해본 결과, PSE는 AMPK의 인산화를 6시간까지 증가시켰으며( Fig. 4 ), AMPK 상위 인산화효소(upstream kinase)인 LKB1은 3시간에서 6시간까지 증가하였다 (data not shown). 그리고, 이와 더불어 AMPK의 하위 기질인 ACC의 인산화도 30분부터 6시간까지 증가하였다( Fig. 4 ).
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Activation of AMPK. Immunoblot analyses were performed on lysates of HepG2 cells that had been treated with 30 μg/mL of PSE for the indicated time period.
다음으로 PSE의 AMPK 활성화가 미토콘드리아 보호 효과에 미치는 영향을 확인하기 위하여 AMPK 억제제인 Compound C를 사용하였다. 4 , 24) Compound C를 전 처리한 후, PSE의 세포보호 효과가 사라지는 것을 관찰하였다( Fig. 5 ). 이는, PSE의 간세포 보호 효과에 AMPK 활성화가 관여함을 제시하고 있다.
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Role of AMPK activation in mitochondrial function. After treatment with 5 μM compound C for 1h, cells were incubated with AA+iron and/or PSE. Data represent the mean±S.D. from three separate experiments. The statistical significance of differences between treatments and either the vehicle-treated control (##p<0.01) or cells treated with AA+iron (**p<0.01) was determined.
고 찰
생명체는 필수적으로 산소를 이용하므로 oxidative stress에 노출되는 것을 피할 수 없으며, 이는 세포의 노화 및 암, 당뇨병, 동맥경화증 등 대표적인 만성질환의 발생에 중요한 역할을 하고 있다. Oxidative stress는 유산소 대사과정에서 체내에 존재하는 oxidant와 anti-oxidant의 불균형에 의해 초래되며, 25) 이 과정에서 생성된 ROS는 세포내에 존재하는 superoxide distumase, catalase, glutathione reductase 등의 다양한 항산화 효소에 의해 제거된다. 2 - 4) 그러나 과도하게 생성된 ROS는 oxidative stress를 유발하고, 생체막 내 인지질의 변성 및 세포나 조직의 손상을 야기한다. 이처럼 oxidative stress는 세포와 조직의 비특이적 손상을 야기하고 유전자의 변형을 초래하기도 하지만, 세포의 성장, 생존 및 기능을 조절하는 물질로서도 중요한 역할을 하므로 질병의 치료를 위해서는 oxidative stress를 적절히 조절해야 된다. 26)
하고초(夏枯草)는 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 전초로서, 한의학에서 청간, 이뇨, 소염, 해열, 혈압강하 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 17) 항균, 항암, 항알레르기 및 항산화 작용에 관한 연구 결과가 보고되어 있고, 생리 활성 성분으로는 ursolic acid, caffeic acid, 카로티노이드, 타닌, 유기산 등이 알려져 있다. 17 - 20 , 22) 그동안 하고초 및 그 활성 성분들의 효능 연구는 많이 되어 왔지만, 그 기전에 대한 연구는 아직 미비한 실정이다. 17 - 20) 따라서, 본 연구에서는 하고초의 간보호 및 항산화 효능을 평가하고, 그 기전에 대한 연구를 진행하였다.
이전의 간세포 손상 기전 연구들에 의하면, AA와 iron 처치는 세포 내 ROS를 증가시키는 산화적 스트레스 유도 물질로 이용될 수 있어 간세포 보호 또는 항산화 물질들의 효과를 평가하는 지표로 연구되어 왔음을 확인할 수 있었다. 4) 따라서 본 연구에서도 간세포에 AA와 iron의 처치로 oxidative stress로 인한 apoptosis를 유발하여, 하고초 추출물(PSE)의 간보호 및 항산화 효과를 알아보았다. 먼저, MTT 측정법을 이용하여 세포생존율을 측정하였고, apoptosis 관련 단백질인 PARP와 pro-caspase3의 발현 변화를 immunoblot assay로 확인하였다. 그 결과, AA와 iron의 처치로 유도된 세포 손상 및 apoptosis는 PSE 전처리시 농도 의존적으로 억제되고 동시에 apoptosis 관련 분자들의 단백 발현이 정상화 되는 것으로 보아, PSE는 세포를 보호하는 효과를 가지는 것으로 판단할 수 있었다.
세포내 oxidative stress는 다양한 방법으로 측정할 수 있는데, 본 연구에서는 비극성 분자인 H 2 DCF-DA가 세포내로 들어가 esterase에 의해 비형광성 극성분자인 H2DCF로 분리되어 세포 내 ROS에 의해 산화되면서 형광성 인자 DCF로 전환되어 녹색 형광을 발하는 방법을 이용하여 측정하였다. 4) 그 결과, PSE는 ROS 생성을 유의적으로 억제하였고, 이는 PSE가 oxidative stress로부터 생성된 ROS를 억제하여 간세포를 보호한다는 것을 나타낸다.
세포내 소기관인 미토콘드리아는 oxidative phosphorylation을 통하여 ATP를 생성하여 세포의 형태와 기능을 유지하는데 필요한 에너지로 공급한다. 16) 미토콘드리아가 ROS에 노출되면, 미토콘드리아 막투과성 변이공(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)이 열리고, 수소이온(H+) 이동의 동력인 미토콘드리아 막전위(mitochondrial membrane potential, MMP)와 pH 차이가 사라져 oxidative phosphorylation이 방해를 받아 ATP 합성이 중단될 뿐만 아니라, 가수분해가 촉진되어 ATP가 감소한다. 27 , 28) 또한, 칼슘이온(Ca 2+ )이 축적되어 apoptosis를 일으키는데, oxidative stress 조건에서는 mPTP에 있는 Ca 2+ 결합 부위의 민감도가 변하여 쉽게 Ca 2+ 이 축적된다. 29 - 31) 이를 토대로 본 연구에서는, flow cytometry system을 이용하여 MMP를 측정하였고, AA와 iron 처치로 유도된 mitochondrial dysfunction으로부터 PSE가 미토콘드리아를 보호한다는 것을 확인하였다.
AMP-activated protein kinase (AMPK)는 세린/트레오닌 계열의 단백질 인산화 효소(serine/threonine kinase)로서 지질과 포도당 대사의 조절인자로 알려져 있다. 32) 이들은 α, β, γ의 3개 소단위로 구성되어 있고, α 소단위의 N-말단(N-terminal) 내 catalytic site에 있는 Thr-172 인산화에 의해 활성화된다. 32 , 33) AMPK는 정상 환경에서는 비활성 상태로 있다가 과격한 운동, 저혈당 및 저산소증 등 AMP/ATP 비율을 증가시키는 신호전달기전과 세포내 oxidative stress에 의해 활성화된다. 활성화된 AMPK는 지방산 합성을 유도하는 AMPK 하위 인자인 acetyl CoA carboxylase (ACC)를 억제하여 체내 지질 대사를 조절하거나 포도당 신생합성(gluconeogenesis)을 억제하여 포도당 대사 조절에 영향을 미친다. 또한 이화반응(catabolism)을 유도하여 ATP 생성을 증가시키고, ATP를 소모하는 세포성장 및 세포증식을 억제하여 세포내 에너지 항상성을 유지한다. 34 - 36) AMPK의 상위 인산화 효소에는 liver kinase B1 (LKB1), Ca 2+ /calmodulin-dependent protein kinase kinase β (CaMKKβ), 그리고 TGFβ-activated kinase (TAK-1) 등이 있다. 이 중 LKB1은 AMP의 γ 소단위 부착을 강화시켜, 세포증식을 조절하고, 종양억제 효과를 가지고, Ca 2+ 에 의해 활성화되는 CaMKKβ에 의한 AMPK 활성화는 신경세포, 혈관내피세포, T 임파구에서 중요한 역할을 하며, cytokine 수용체와 연결된 하위 인산화 효소인 TAK-1은 JNK와 NF-κB 신호전달의 상위 인산화 효소로 작용한다고 알려져 있다. 32 , 36 , 37) AMPK 활성화가 미토콘드리아 막의 보호에 관여한다는 연구결과를 바탕으로, 12) oxidative stress로부터 PSE의 세포 보호 효과의 기전 연구로서 AMPK 신호전달경로를 확인하였다. PSE를 시간을 달리하여 처리한 후, immunoblot assay를 수행한 결과, AMPK의 인산화가 시간 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었고, 나아가 AMPK의 상·하위인자인 LKB1과 ACC의 인산화도 증가함을 관찰할 수 있었다. 또한 PSE와 AMPK 억제제인 compound C를 함께 처리한 후, MMP를 측정한 결과, PSE의 미토콘드리아 보호 효능이 없어지는 것으로 미루어 보아 PSE가 AMPK 활성에 관련되어 있으며, 이를 통하여 oxidative stress로부터 세포보호 효과를 가진다는 것을 알 수 있었다.
결 론
본 연구에서는 하고초 물추출물(PSE)의 항산화 효과와 미토콘드리아 보호 효과를 확인하기 위해 간 실질세포인 HepG2 cell에 AA와 iron의 처리로 유도된 apoptosis로부터 PSE의 세포생존율과 apoptosis 관련 단백질 발현, mitochondrial dysfunction 저해 효과, 항산화 및 AMPK 활성화를 측정하였다.
PSE는 AA+iron에 의해 유도된 ROS 증가 및 세포 손상으로부터 세포를 보호한다.
PSE는 AA+iron에 의해 유도된 mitochondrial dysfunction을 억제한다.
PSE는 AMPK를 활성화하며, 이를 통하여 세포 보호 효과를 가진다.
이후, AMPK 활성화에 관여하는 다양한 분자 기전의 연구 및 추출물에 포함된 성분 분석을 통한 활성성분에 대한 후속 연구가 뒷받침되어야 할 것으로 사료된다.
Acknowledgements
This work was supported by the National Research Foundation of Korea (NRF) grant funded by the Korea government [MSIP] (No.2012R1A5A2A42671316) and the NRF grant funded by the Korea government [MSIP] (No. 2014R1A2A2A01007375).
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