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Relaxation Effects of Eucomiae Cortex in Isolated Rabbit Corpus Cavernosum Smooth Muscle
Relaxation Effects of Eucomiae Cortex in Isolated Rabbit Corpus Cavernosum Smooth Muscle
Journal of Physiology & Pathology in Korean Medicine. 2015. Dec, 29(6): 485-491
Copyright © 2015, The Korean Association of Oriental Medical Physiology
  • Received : October 02, 2015
  • Accepted : December 07, 2015
  • Published : December 25, 2015
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선영 박
blbee@semyung.ac.kr

Abstract
This study was aimed to investigate the relaxation effects of Eucomiae Cortex (EC) extract in isolated rabbit corpus cavernosum smooth muscle and its mechanism. To evaluate the relaxation of EC extract in rabbit corpus cavernosum, EC extract was treated in corporal strips which were precontracted with phenylephrine(PE). To study its mechanism, Nω-nitro-L-arginine (L-NNA) was pretreated after infuse of EC extract and compared with non-treated. In calcium chloride (Ca 2+ ) -free krebs solution, EC extract and Ca 2+ 1 mM were infused by turns after Ca 2+ 1 mM was treated into corporal strips contracted by PE. Cell ability, nitric oxide (NO) and epithelial nitric oxide synthase (eNOS) on human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) were measured by MTT assay, Griess reagent system and histochemical, immunohistochemical methods. EC extract showed a significant relaxation effects on the corporal strips, this effects were inhibited by pretreatment of L-NNA. EC extract inhibited the increase of contraction by Ca 2+ influx in Ca 2+ -free krebs solution, and eNOS positive reaction in corpus cavernosum, NO production in HUVEC increased by treatment of EC extract. These result suggest that the relaxation effects of EC extract in isolated corpus cavernosum smooth muscle are involved in increase of eNOS and NO production, blocking of extracellular Ca 2+ influx.
Keywords
서 론
발기부전은 40대부터 80대까지 남성의 약 10%가 경험하게 되는 성기능장애의 하나로 보고된 바 있으며 1) , 사회가 점차 고령화되면서 환자가 증가하고 있을 뿐만 아니라 젊은 남성으로 확대되고 있는 추세이다.
발기는 시각, 청각, 후각, 촉각 등의 성적 자극이 중추신경계를 흥분시켜 해면체신경 말단과 내피세포에서 nitric oxide(NO)를 분비시키고, 분비된 NO가 음경동맥과 음경해면체의 평활근을 이완시킴으로써 음경해면체 내에 혈액이 충만되어 나타난 결과이다 2) . 그러나 만족스러운 성행위를 할 수 있을 정도로 발기가 충분하지 않거나, 발기가 되더라도 유지되지 못하는 경우를 발기부전으로 정의한다 3) .
이러한 발기부전의 원인으로는 노화, 우울증과 같은 정신적 장애, 말초신경장애와 같은 신경학적 이상, 성선기능저하와 같은 내분비학적 이상, 동맥경화와 같은 혈관질환, 혈압강하제와 같은 약물, 음주나 흡연, 당뇨나 고혈압 등 다양한 인자가 밝혀져 있다 3) .
한의학에서는 발기부전을 陽痿, 陰痿, 筋痿, 莖痿, 陽事不擧등으로 표현하고 있으며, 腎陽虛衰, 心脾損傷, 恐懼傷腎, 肝氣鬱結, 濕熱下注의 원인이 있으나 대부분 陰損及陽하여 陽衰로 陰無所化한 腎陽虛衰를 발기부전의 주요원인으로 인식하고 있다 4 , 5) . 따라서 치료에 있어서도 溫腎壯陽의 治法을 적용하고 있으며 6) , 이와 관련된 약물의 효능검증에 대한 연구도 많이 이루어지고 있다 7 - 9) .
한편 杜沖은 杜冲나무과 식물인 杜冲나무의 나무껍질로 性味가 甘微辛, 溫하고 주로 肝腎經으로 들어가 補肝腎, 强筋骨, 安胎 시키는 효능이 있어 10 , 11) 腰脊酸疼, 足膝痿弱, 小便餘瀝, 陰下濕痒, 胎漏欲墮 등에 많이 사용하는 약물이다 12) .
현재까지 杜沖에 대하여 이 등 13) 은 골다공증 치료효과, 손 등14)은 알레르기성 접촉 피부염 치료효과를 보고하였으며, 이외에도 항노화작용, 항피로작용, 항당뇨작용, 진통 및 신경통 완화작용 15 - 17) , 항고혈압 효능 18) 등 다양한 임상 및 실험연구 결과가 보고되었다.
그러나 杜沖이 補肝腎의 효능이 있음에도 불구하고 腎臟과 관련한 성기능에 대한 연구는 접하지 못하였다. 또한 杜沖이 토끼의 혈관에 대한 확장효과를 나타내므로 19) 음경해면체의 혈관과 평활근에 대한 확장효과를 나타낼 가능성을 추정할 수 있으므로 이의 검증을 통하여 杜沖을 성기능 개선에 활용할 방안을 모색하고자 한다.
이에 본 연구에서는 杜沖 추출물이 발기력에 미치는 영향을 검증하고자 토끼에서 적출한 음경해면체 조직을 이용하여 NO를 중심으로 한 organ bath study와 조직 및 면역화학적 연구를 통하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
재료 및 방법
- 1. 실험동물
체중 2 kg 내외의 New zealand white 수컷 토끼와 10주령의 SHR/Izm Rat(샘타코, 한국)를 사용하였고, 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 1주 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 실험하였다.
본 동물실험은 세명대학교 동물실험윤리위원회의 승인(smecac 14-10-01)하에 실시되었다.
- 2. 杜冲 추출물 제조
杜冲( Eucomiae Cortex , EC) 200 g을 증류수 2000 ㎖과 함께 round flask에 넣고 2시간 동안 가열 추출한 다음 rotary evaporator(Eyela, Japan)로 감압 농축하고 동결건조기로 건조하여 얻은 23 g의 분말을 실험에 사용하였다.
- 3. 음경해면체 이완효과 측정
- 1) 해면체절편의 제작
토끼를 urethane(2.5 g/㎏, 정맥주사)로 마취한 후 하복부를 절개하고 음경을 적출하여 4℃의 modified krebs-ringer bicarbonate solution(125.4 mM NaCl, 4.9 mM KCl, 2.8 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO 4 , 15.8 mM NaHCO 3 , 1.2 mM KH 2 PO 4 , 12.2 mM glucose, pH 7.4)에 담았으며, 음경 주위의 지방조직과 백막을 제거하고 해면체 조직을 절단하여 2×2×6 ㎜ 크기의 음경절편을 제작하였다.
- 2) 등장성 수축 측정
음경절편은 95%의 O 2 와 5%의 CO 2 혼합가스로 포화된 37 ℃의 modified krebs-ringer bicarbonate solution이 peristaltic pump를 통하여 3 ㎖/min의 속도로 흐르고 있는 organ bath(용량 1.5 ㎖)에 현수하였다. 음경절편의 한쪽 끝은 organ bath의 바닥에 고정시키고 다른 쪽은 force transducer에 연결하여 장력을 측정하고 그 결과를 physiograph(PowerLab, Australia)로 기록하였다.
실험시작 전 음경절편을 organ bath에서 1시간 안정시킨 후 micromanipulator (Narishige N 2 , Japan)를 이용하여 피동장력 1.5 g을 가하고 다시 2시간 안정시킨 다음 실험을 진행하였으며, 연속되는 실험에는 다른 처치 전에 다시 1시간 안정시킨 다음 시행하였다.
- 3) 杜冲의 음경해면체 이완효과와 작용기전 검증
음경절편에 phenylephrine(PE, 10-6 M)을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 杜冲 추출물을 농도별(0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3 ㎎/㎖)로 투여하여 이완효과를 기록하였다.
이완효과의 기전을 검증하기 위하여 Nω-nitro-L-arginine(L-NNA, 10-4 M)을 15분간 전처치하고 PE로 수축을 유발시킨 다음 杜冲 추출물을 농도별(0.1, 0.3, 1, 3 ㎎/㎖)로 투여하여 수축의 변화를 기록한 후 L-NNA를 전처치하지 않은 경우와 비교하였다.
杜冲의 음경해면체 이완효과에서 Ca 2+ 의 관계 여부를 검증하기 위하여 Ca 2+ -free solution에서 해면체절편을 PE로 수축시킨 후 Ca 2+ (1 mM)을 투여하여 수축의 변화를 기록하였다. 동일한 음경절편을 1시간 회복시킨 후 杜冲 추출물(3 ㎎/㎖)을 10분간 전처치하고 PE로 수축시킨 다음 Ca 2+ (1 mM)을 투여하여 수축의 변화를 기록하여 杜冲을 전처치하기 전과 비교하였다.
- 4. 음경해면체 조직학적 변화 측정
- 1) 음경해면체 조직표본 제작
흰쥐를 Ether로 마취한 후 하복부를 절개하고 음경을 적출하여 4℃의 modified krebs-ringer bicarbonate solution(125.4 mM NaCl, 4.9 mM KCl, 2.8 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO 4 , 15.8 mM NaHCO 3 , 1.2 mM KH 2 PO 4 , 12.2 mM glucose, pH 7.4)에 담았다. 음경 주위의 지방조직을 제거하고 2 ㎜ 두께의 음경절편을 제작한 다음 정상인 대조군과 PE(10-6 M)를 단독 처리한 PE군, PE(10-6 M)와 杜冲(3 ㎎/㎖)을 동시에 처리한 杜冲군으로 구분하여 제작하였다. 제작된 표본은 실온에서 24시간동안 10% NBF에 고정하였다. 고정된 조직은 통상적인 방법으로 paraffin에 포매한 후 3 ㎛ 두께의 연속절편으로 제작하였다.
- 2) 음경해면체 조직화학
음경해면체에 분포하는 평활근과 아교섬유의 분포 변화를 관찰하기위해 Masson trichrome 염색을 실시하였다. 우선 50-60℃ Bouin 용액에서 1시간동안 매염 처리한 다음 70% 에탄올에서 picric acid를 제거하였다. Weigert iron hematoxylin에서 10분동안 반응시켜 핵을 염색하고, Biebrich scalet-acid fuchsin와 phosphomolybdic-phosphotungstic acid에서 각각 15분간, aniline blue에 5분간 처리하여 평활근(적색)과 아교섬유(청색)를 염색하고 광학현미경(BX50. Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 영상분석을 통해 음경해면체내 아교섬유에 대한 평활근의 분포비율을 계산하였다.
- 3) 음경해면체 면역조직화학
음경해면체의 발기기전에 관여하는 eNOS 분포 변화를 관찰하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 음경절편을 proteinase K(20 ㎍/㎖)에 5분 동안 proteolysis 과정을 거친 후 blocking serum인 10% normal goat serum에서 2시간 동안 반응시켰다. 그리고 1차 항체인 mouse anti-eNOS(1:100, Santa Cruz Biotec)에 4℃ humidified chamber에서 72시간 동안 반응시켰다. 다음 2차 항체인 biotinylated goat anti-mouse IgG2a(1:100, DAKO, USA)에 실온에서 24시간 link 하였고, 다음 avidin biotin complex kit(Vector Lab, USA)에 1시간동안 실온에서 반응시켰다. 0.05% 3,3'-diaminobenzidine과 0.01% HCl이 포함된 0.05M tris-HCl 완충용액 (pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하였다. 영상분석을 통해 음경해면체내 eNOS의 반응을 계산하였다.
- 5. 세포실험
사람의 제대정맥내피세포인 human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)은 CloneticsTM and PoieticsTM(Lonza, USA)에서 구입하여 passage 3~7번까지 사용하였으며, 세포배양을 위해 endothelial cell basal medium-2(EBM-2) bullet kit (Lonza, USA)을 이용하여 37℃, 5% CO 2 조건하에서 배양하였다. EBM-2 배지는 사용 전 EGM-2 SingleQuots(10% fetal bovine serum, hydrocortisone, hFGF-B, vEGF, R3-IGF-I, ascorbic acid, hEGF. GA-1000, heparin)을 넣고 잘 섞어서 사용하였다.
70~80%정도 confluent한 세포는 HEPES-buffered saline solution을 주입하여 씻어내고, trypsin/EDTA solution(2 ㎖)을 넣어 flask에 부착된 세포를 떼어낸 후 trypsin neutralizing solution을 첨가하여 원심분리(220 xg, 5분)하였다. 침전물에 새로운 배지를 넣어서 cell count하여 세포를 96-well plate(5×103 cells/well)에 심은 다음 24시간 동안 CO 2 incubator에서 배양하였다.
- 1) 세포독성 측정
Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 배지로 37℃, 5% CO 2 하에서 24시간 배양한 human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)에 杜冲 추출물을 농도별로 처리한 다음 12시간 배양하여 세포생존율을 MTT assay로 측정하였다 20) . MTT(methylthiazol-2-yl-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide, 5 ㎎/㎖)를 20 ㎕ 넣고, 세포 배양기에서 4시간 방치하였다. 상층액을 제거한 뒤 formazan 침전물은 DMSO를 200 ㎕씩 넣어 약 15 분간 녹였다. 540 ㎚의 파장에서 ELISA microplate reader로 흡광도를 측정하여 세포생존율을 계산하였다.
- 2) Nitric oxide 측정
Nitric oxide(NO) 생성 정도는 Griess reaction 21) 에 준하여 microplate reader로 NO 생성의 지표인 배지에 생성된 nitrite 양을 측정하여 결정하였다. 杜冲 처리 12시간 후에 배양액 50 ㎕에 Griess reagent(1% sulfanilamide, 0.1% naphtylethylene diamide 및 2.5% 인산)를 동량 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 550 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. Nitrite 양의 측정은 sodium nitrite를 농도별로 조제하여 만든 표준곡선을 이용하여 산출하였고, 생성된 nitrite의 양은 μM로 환산하여 나타내었으며, 각 실험에서 기본 대조군은 세포 배양액을 사용하였다.
- 6. 영상분석과 통계처리
조직화학과 면역조직화학의 결과의 수치화를 위해 Image pro Plus (Media Cybernetic, USA)을 이용한 영상분석 (image analysis)을 실시하였다. 실험결과는 평균과 표준편차로 나타내었으며, 실험결과의 비교는 sigma plot 4.1을 이용하여 student's t-test를 시행하였고, 유의성은 p<0.05로 판정하였다.
결 과
- 1. 杜冲의 음경해면체 이완효과
杜冲은 PE로 수축시킨 음경절편에 대하여 0.3, 1, 3 ㎎/㎖에서 각각 유의성 있는 이완효과를 나타내었다( Table 1 , Fig. 1 ).
The Effects of Eucomiae Cortex in isolated strips of rabbit corpus cavernosum smooth muscle precontracted with PE.
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Values are mean±standard deviation(n=14). EC extract-induced relaxation was expressed as percentage of PE-contraction. PE, phenylephrine 1 μM ; EC, Eucomiae Cortex extract(㎎/㎖) ; * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 compared with PE.
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The concentration-response curve of Eucomiae Cortex in isolated strips of rabbit corpus cavernosum smooth muscle precontracted with PE. PE, phenylephrine 1 μM ; EC, Eucomiae Cortex extract(㎎/㎖) ; W/O, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.
- 2. L-NNA의 전처치가 杜冲의 해면체이완효과에 미치는 영향
음경절편을 PE로 수축시키고 杜冲 추출물을 농도별로 투여하였을 때, L-NNA를 전처치하지 않은 경우는 1, 3 ㎎/㎖에서 각각 유의성 있는 이완효과를 나타내었고, L-NNA를 전처치한 경우는 3 ㎎/㎖에서 유의성 있는 이완효과를 나타내었다. 그러나 L-NNA를 전처치하지 않은 경우에 비하여 L-NNA를 전처치한 경우 杜冲 추출물의 이완효과는 0.3, 1, 3 ㎎/㎖에서 유의성 있게 억제되었다.
Effects of pre-treatment of L-NNA on Relaxation effects ofEucomiae Cortexin isolated rabbit corpus cavernosum smooth muscle.
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Values are mean±standard deviation(n=13). EC extract-induced relaxation was expressed as percentage of PE-contraction. PE, phenylephrine 1 μM ; EC, Eucomiae Cortex extract(㎎/㎖) ; ** p<0.01, *** p<0.001 compared with PE ; ### p<0.001 compared with PE+EC in non treatment of L-NNA.
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Effects of pre-treatment of L-NNA on Relaxation effects of Eucomiae Cortex in isolated rabbit corpus cavernosum smooth muscle. PE, phenylephrine 1 μM ; EC, Eucomiae Cortex extract(㎎/㎖) ; L-NNA, Nω-nitro-L-arginine 10 μM ; W/O, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.
- 3. 杜冲의 전처치에 따른 Ca2+의존성 수축의 변화
Ca 2+ 이 제거된 상태의 krebs-ringer solution에서 PE로 수축을 유발시킨 후 Ca 2+ 1 mM을 투여하였을 때 1.12±0.23 g의 수축을 나타내었으나, 杜冲을 전처치한 다음 PE로 수축을 유발시킨 후 Ca 2+ 1 mM을 투여하였을 때는 0.68±0.21 g의 수축을 나타내어 杜冲 추출물이 Ca 2+ 유입에 따른 수축의 증가를 유의성 있게 억제하였다.
Effects of pre-treatment ofEucomiae Cortexon calcium-induced contraction of corpus cavernosal strip in calcium free media.
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Values are mean±standard deviation(n=8). EC, Eucomiae Cortex extract 3 ㎎/㎖ ; PE, phenylephrine 1 μM ; Ca, calcium chloride 1 mM ; ## p<0.01 compared with PE+Ca in non treatment of EC.
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Effects of pre-treatment of Eucomiae Cortex on calcium-induced contraction of corpus cavernosal strip in calcium free media. PE, phenylephrine 1 μM ; Ca, calcium chloride 1 mM ; EC, Eucomiae Cortex extract 3 ㎎/㎖ ; W/O, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.
- 4. 음경해면체내 민무늬근 분포 변화
조직화학결과 아교섬유는 음경해면체 중심부와 백막주변부에서 관찰되었다, 평활근은 음경해면체에 분포하는 아교섬유 사이 공간에서 관찰되었는데, 특히 杜冲군에서는 음경해면체 중심부에 분포하는 아교섬유사이에서 많이 관찰되었다( Fig. 4 ).
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Results of Masson trichrome's stain for Penis(x40). A. Control group. B. PE group. C. EC group. CCP, corpus cavernosum of penis. CSP, corpus spongiosum of penis. DOR, dorsal region of penis.
영상분석결과 음경해면체내 아교섬유에 대한 평활근의 분포비율은 대조군에서 1 : 0.06, PE군에서는 1 : 0.02 그리고 杜冲군에서는 1 : 0.09로 나타났다.
- 5. 음경해면체내 eNOS 분포 변화
면역조직화학 결과 eNOS 양성반응은 음경해면체 중심부 주변 나선동맥의 평활근에서 관찰되었다( Fig. 5 ). 영상분석결과 대조군은 2,238±162/1,000,000 pixel, PE군은 1,398±77/1,000,000 pixel 그리고 杜冲군은 75,660±1,597/1,000,000 pixel로 나타났다.
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Immunohistochemistry of eNOS in Penis(x400). A. Control group. B. PE group. C. EC group. H, helicine artery in CCP. S, Sinus in CCP. SV, small vein. arrow, eNOS positive reaction.
- 6. 杜冲의 세포독성 측정
Human umbilical vein endothelial cell(HUVEC)에 杜冲 추출물을 농도별로 12시간 처치한 후 MTT assay를 통해 세포 생존율을 측정한 결과 杜冲 추출물의 농도 100, 300, 500, 1000 ㎍/㎖에서 모두 세포 생존율에 변화가 없었다( Fig. 6 ).
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Effects of EC extract on the viability of human umbilical vein endothelial cell(HUVEC). Representative bars are shown as the cell viability in HUVEC treated with EC extract(100, 300, 500 and 1000 ㎍/㎖) for 12 hr at 37℃. EC, Eucomiae Cortex extract.
- 7. 杜冲이 NO의 생성에 미치는 영향
Human umbilical vein endothelial cell(HUVEC)에 杜冲 추출물을 농도별로 12시간 처치한 후 NO 량을 측정하였을 때 control에서 측정된 NO 량인 4.73 ± 0.12 μM에 비하여 杜冲 추출물 500 ㎍/㎖의 농도에서 5.61 ± 0.00 μM, 1000 ㎍/㎖의 농도에서 7.70 ± 0.12 μM, 의 NO가 측정되어 유의성 있는 증가를 보였다( Fig. 7 ).
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Effects of EC extract on nitric oxide concentration in human umbilical vein endothelial cell(HUVEC). Representative bars are shown as the nitric oxide concentration in HUVEC treated EC extract(100, 300, 500 and 1000 ㎍/㎖) for 12 hr at 37℃. EC, Eucomiae Cortex extract ; NO, nitric oxide ; *** p<0.001 compared with Control.
고 찰
발기는 신경계와 혈관계의 통합작용으로 일어나는데, 본질적으로는 음경해면체내 혈액 유입의 증가로 발생한다. 해면체 동맥은 음경 내 혈액을 공급해주며, 도출정맥을 통해 음경내 혈액이 빠져 나가는데, 발기 발생 시 평활근이 이완됨으로써 음경 내 혈액 유입은 더욱 증가되고, 음경해면체내 혈액강들은 더욱 확장된다. 이 확장으로 인하여 음경해면체내 도출정맥은 기계적으로 압박받고, 이로 인해 음경내로 들어온 혈액이 빠져나가는 것이 지연되면서 발기현상이 유지된다 3) .
음경 내 혈액흐름은 음경해면체 동맥과 음경해면체 평활근을 조절하는 해면체 신경에 의하여 조절되는데 22) , 이 신경은 NO를 평활근으로 많이 운반함으로써 음경해면체의 이완을 돕는다. NO는 eNOS에 의해 생성되는 비신경전달물질로, 주로 혈관내피세포에 많이 분포되어 있다 23) . 음경해면체에서 eNOS에 의해 생성된 NO는 음경해면체의 평활근으로 확산되어 cyclic guanosine monophosphate(cGMP)를 생산하는 guanylate cyclase를 활성화 시키고, 이로 인해 칼슘 이온 채널의 삼투성 변화로 세포질 내 칼슘이 감소되어 평활근 이완과 혈액 유입 증가를 일으킨다 3 , 24) . 따라서 발기현상이 일어나기 위해서는 NO를 생성하는 eNOS와 cGMP의 활성을 증가시킬 NO의 작용이 중요하다.
한의학에서는 발기를 비롯한 제반 성기능은 腎臟의 기능을 기반으로 하는 기능으로 腎精이 충만되었을 때 발휘되며 4 , 5) , 치료에 있어서도 腎臟기능을 보강하는 약물을 많이 활용하고 있다 6) .
특히 한약물이 음경해면체 조직에 미치는 영향에 대한 연구로 황 등 25) 은 加味歸脾湯이 음경해면체의 평활근을 이완시키며, 박 등은 蓮子肉 26) , 益智仁 27) , 腎氣丸 28) 이 음경해면체 조직의 아교섬유에 대한 평활근 비율을 증가시킨다고 보고한 바 있다.
한편 杜冲은 肝과 腎을 補하고 筋骨을 强하게 하는 强壯, 强精 작용이 있다고 기재되어 있으며 29) , 腎精을 補益하는 목적에도 많이 활용되는 대표적 약재이다 30) . 그럼에도 불구하고 杜沖의 補肝腎의 효능과 관련한 성기능에 대한 연구는 접하지 못하였다.
그러나 杜冲의 혈압강하효능 31) 과 토끼의 혈관에 대한 확장효과 19) 는 杜冲이 혈관평활근의 확장을 통하여 강압작용을 하는 것을 의미하므로, 음경해면체의 혈관과 평활근을 확장시켜 음경의 발기에 유익한 효과를 나타낼 가능성도 있을 것으로 예상하였다.
이에 본 연구는 補肝腎하여 强精의 효능이 있는 杜冲이 腎臟과 관련한 성기능에 미치는 영향을 알아보고자 organ bath study, 조직화학, 면역조직학적 방법을 이용하여 음경해면체 이완에 중요한 역할을 하는 NO를 중심으로 杜冲 추출물이 음경해면체혈관과 평활근 이완에 미치는 영향을 실험하였다.
먼저 PE로 최대 수축시킨 음경해면체 절편에 杜冲 추출물을 농도별로 투여하였을 때 杜冲 추출물 0.3, 1, 3 ㎎/㎖의 농도에서 유의한 이완효과가 나타났으며 이를 통해 杜冲이 음경해면체에 대해 이완효과를 가진다는 사실을 알 수 있다.
L-NNA는 내피세포에서 eNOS에 의한 NO의 생성을 차단하는 억제제 32 , 33) 로, L-NNA를 15분간 전처치한 후 PE로 수축시킨 다음 杜冲 추출물을 투여하였을 때 杜冲의 음경해면체 이완효과가 유의하게 억제되었다. 이는 L-NNA가 eNOS에 의한 NO의 생성을 차단하였기 때문에 杜冲이 음경해면체 이완효과를 나타내지 못한 것으로, 이를 통해 杜冲의 음경해면체 이완효과가 eNOS에 의한 NO 생성을 통하여 일어난다는 것을 알 수 있다.
음경해면체의 혈관과 평활근의 수축은 막전압의 변동에 의존하는 Ca 2+ channel인 voltage operated channel(VOC)을 통하여 Ca 2+ 의 유입이 증가하고, 이러한 Ca 2+ 의 증가로 수축성 단백질이 활성화되어 수축이 초래되지만 Ca 2+ 의 유입이 차단되면 이완되어 발기를 일으킨다 34 , 35) . 杜冲 추출물이 음경해면체 이완효과와 Ca 2+ 과의 상관성을 알아보기 위해 Ca 2+ 이 제거된 krebs-ringer solution에서 杜冲 추출물을 전처치한 후 PE로 수축을 유발시킨 다음 Ca 2+ 1 mM을 투여하였다. 그 결과 Ca 2+ 유입에 따른 수축의 증가는 杜冲 추출물의 전처치에 의해 유의하게 억제되었는데, 이를 통해 杜冲 추출물이 음경해면체 내 Ca 2+ 유입을 차단함으로써 평활근을 이완시킨다는 사실을 알 수 있다.
조직화학적 실험에서 대조군에 비하여 杜冲군에서 음경해면체내 아교섬유에 대한 평활근의 분포비율이 증가되어 나타났는데, 이결과는 杜冲 추출물이 음경해면체내 평활근을 이완시킨 것으로 추정된다. 또한 면역조직학적 결과 대조군에 비해 杜冲군에서 eNOS 양성반응이 증가되었으며, 이는 杜冲 추출물이 음경해면체 내에서 eNOS의 생성을 증가시킨 것을 나타낸다. 그리고 HUVEC을 이용한 세포실험에서도 杜冲 추출물 처치에 따른 NO량이 증가되는 결과가 나타났으며, 이는 organ bath study 및 면역조직학적 결과와 함께 杜冲의 음경해면체 이완효과에 NO가 관계된다는 사실을 뒷받침해준다.
이상의 결과를 종합해보았을 때, 杜冲 추출물은 eNOS의 활성증가를 통하여 NO의 생성 증가시키고, NO가 음경해면체 평활근의 cGMP의 활성을 증가시킴으로써 세포외 Ca2+ 유입이 차단되는 과정을 통하여 음경해면체를 이완시킨다는 것을 알 수 있다. 따라서 杜冲의 補腎, 强精 작용을 이용하여 음경의 발기와 관련된 성기능 개선에 활용할 가능성을 확인할 수 있었다.
결 론
杜冲 추출물이 음경해면체 평활근 이완에 미치는 영향을 알아보고자 organ bath study, 조직화학, 면역조직학적 방법을 이용하여 NO를 중심으로 한 실험을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
杜冲 추출물은 음경해면체 평활근에 대해 유의한 이완효과를 나타내었다.
杜冲 추출물의 음경해면체 평활근 이완효과는 L-NNA의 전처치로 억제되었다.
杜冲 추출물은 Ca 2+ -free solution에서 Ca 2+ 유입에 따른 수축의 증가를 억제하였다.
杜冲 추출물은 음경해면체내 아교섬유에 대한 평활근의 분포비율을 증가시켰고 eNOS 양성반응도 증가시켰다.
杜冲 추출물은 HUVEC 내 NO 생성량을 증가시켰다.
이상의 결과를 보면, 杜冲 추출물은 eNOS의 생성을 증가시키며, 이를 통한 NO의 생성 증가 및 세포외 Ca 2+ 유입의 차단을 통하여 음경해면체를 이완시키는 것으로 추정된다.
Acknowledgements
이 논문은 2015학년도 세명대학교 교내학술연구비 지원에 의해 수행된 연구임.
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