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Morphological Studies on the Inhibitory Effects of Photoaging Skin of Fermented Red Ginseng in Hairless Mice
Morphological Studies on the Inhibitory Effects of Photoaging Skin of Fermented Red Ginseng in Hairless Mice
Journal of Physiology & Pathology in Korean Medicine. 2014. Apr, 28(2): 206-216
Copyright © 2014, The Korean Association of Oriental Medical Physiology
  • Received : January 02, 2014
  • Accepted : February 07, 2014
  • Published : April 25, 2014
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About the Authors
창현 이
호일 김
종석 김
미진 오
선웅 김
상용 마
명순 김
진 권
한솔 정
찬호 오
choh@ws.ac.kr

Abstract
To investigate the anti-photoaging effect of fermented Red Ginseng(RG) in SKH-1 mice. We examined the effects of extracts of non-fermented RG(NRG group), fermented RG(FRG group) and fortified fermented RG(FFRG group) on skin wrinkles formation, histological changes related to the number of epidermal cell layers, epidermal thickness, neutrophil infiltration into dermis, degradation of collagen fibers, and the number of mast cells, and immunohistochemical changes related to cytokines and enzymes in photoaging skin caused by UVB irradiation of SKH-1 mice. The oral administration(300 mg/Kg B.W./day) and topical application(100 ㎕/mouse/day) of extracts of NRG, FRG and FFRG inhibited increases in epidermal thickness and wrinkle formation compared to control group in dorsal skin induced by UVB irradiation. We observed more increased stainability of acid fuschin and aniline blue in dermis of FFRG group than those of other groups. Furthermore, NRG, FRG and FFRG prevented the disruption of collagen fibers within papillary layer of dermis, and decreased number of mast cells in the dorsal skins induced by UVB irradiation. We observed fine wrinkle formation in FFRG group. Treatment with NRG, FRG and FFRG decreased immunohistochemical density of myeloperoxidase related to inflammation in the photoaging skin. We observed more decreased immunohistochemical density of myeloperoxidase in FFRG group than those of other groups. Immunohistochemical density of PCNA and Ki-67 in FFRG group was more decreased than those of other groups. Our study suggests that fermented red ginseng extracts participates in inhibitory effects in the morphological processes related to photoaging skin on UVB irradiated SKH-1 mice.
Keywords
서 론
피부의 노화는 나이가 증가하면서 개인적인 유전인자에 의하여 발생하는 내재적인 노화(intrinsic aging)와 자외선과 외부물질의 자극에 의한 산화적 스트레스에 의한 광노화(photoaging)로 분류한다 1) .
내재적인 노화는 나이가 증가하면서 피부의 구조와 기능이 퇴행하여 피부가 건조해지며, 잔주름이 생성되고, 탄력이 소실되는 임상적인 특징을 나타내고, 조직학적으로는 표피의 위축, 표피-진피 결합부위의 편평함 및 비정상적으로 elastin의 축적이 일어난다 2) . 광노화는 자외선 B(ultraviolet B, UVB)에 의하여 피부주름이 조기에 형성되며, 피부가 건조해지며, 색소가 침착되고, 말초혈관이 확장되는 임상적인 특징을 나타낸다 3 , 4) . 또한 세포의 비전형화, 아교질의 감소, 탄력섬유가 소실되는 조직학적인 특징을 나타낸다 2 , 5) .
자외선에 노출되면 진피층의 섬유아세포에서 아교섬유의 생성을 감소시키는데, 이는 자외선에 의하여 진피층내 존재하는 기질금속 단백질 분해 효소(matrix metalloproteinases, MMPs)의 활성을 증가시켜 아교섬유를 분해함으로써 피부에 주름을 지게하고 탄력을 감소시켜 노화를 촉진한다고 알려졌다 6 , 7) .
광노화에 대한 조직학적 및 미세구조적 연구에 의하면, 표피의 변화는 최소한으로 발생하나, 대조적으로 손상된 진피의 결합 조직에서는 비조직화된 교원원섬유가 발생하여 비정상적인 형태의 탄성물질이 많이 축적되는 광선탄력섬유증(solar elastosis)의 을 특징을 나타낸다 8) .
최근의 피부노화에 대한 연구는 새로운 피부노화 억제제나 치료제 개발을 위한 연구가 활발히 진행되고 있으나 대부분 유기합성에 의하여 개발된 비타민 유도체가 많이 사용되고 있다 9) . 이러한 유도체들은 분자 자체가 매우 불안정하여 강한 피부자극을 유발하게 되고, 적은 양이라도 체질에 따라 민감한 반응을 일으킬 수 있으므로 피부노화를 예방하기 위하여 부작용이 적은 기능성 소재를 천연물에서 찾으려고 하고 있다 10 - 12) . 국내에서도 hairless mice나 인체 피부세포 및 사람을 대상으로 피부내 부작용이 적은 천연 식물소재에서 항노화의 예방과 치료를 위한 기능성 물질을 찾기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다 13 - 15) .
최근에는 새로운 기능성 물질을 찾기 위하여 한약에 미생물을 결합시킨 발효공법이 이용되고 있다. 발효한약은 의학, 미생물학, 식품학 등이 결합된 형태로서 형태로서 표준화된 제조법 등에 대한 과학적으로 정형화된 방법은 아직 정립되어 있지 않으나, 단미 한약재, 복합 한약재 또는 전탕된 한약재에 세균, 곰팡이, 효모, 버섯류를 사용하여 호기성 혹은 혐기성 조건에서 발효시키는 다양한 방법이 제시되고 있다 16) . 그러나 임상적으로는 발효 한약은 비만, 노인성 질환, 퇴행성 질환 등의 치료 및 만성난치성 질환의 예방에 효과적이나 발효 한약의 안전성과 유효성은 임상적으로 검증된 부분은 미비한 실정이다.
특히 국내에서 홍삼을 이용한 피부노화 개선에 대한 실험적 연구는 대두와 홍삼 혼합분말을 이용하여 자외선에 의한 피부주름 개선효과와 피부 손상에 대한 치유능력 개선 17) , 홍삼추출물에 의한 광노화에 의한 주름형성억제와 아교섬유 분해억제, MMP-1 18) , MMP-13과 MMP-9 억제효과 등 19) 에 대하여 보고하였고, 또한 사람에서도 홍삼식이가 목피부의 홍반 억제, 탄력성 개선, 멜라닌 생성을 억제한다고 보고하였다 17) . 또한 발효 홍삼에 의한 뇌 혈류 개선 효과를 확인하였으며, 이를 통해 발효 홍삼이 뇌 혈류 개선 또는 뇌 혈관 질환 예방 목적으로 유용하게 이용될 수 있다고 보고하였다 20) .
본 연구에서는 기능성이 강화된 홍삼을 개발하기 위한 연구의 일환으로 미생물 발효공정에 의하여 사포닌 성분을 강화시킨 발효홍삼 추출물을 이용하여 광노화 피부개선 효과를 hairless mice를 이용하여 형태학적으로 관찰하고자 하였다.
재료 및 방법
- 1. 실험동물
본 실험에 사용한 실험동물은 7주령, 숫컷, hairless 생쥐(SKH-1 hairless mice)를 오리엔트바이오에서 분양받아 1주일간 사육실에서 적응시킨 후 항온항습(22±2℃, 65±2% RH)하에서 사육하였고, 사료는 시판하는 고형사료를 공급하였다. 실험동물은 5개군으로 분류하여 군별로 5마리씩 배정하여 실험에 사용하였다. 실험군은 정상군, 대조군, non-fermented red ginseng(비발효 홍삼, NRG), fermented red ginseng(발효홍삼, FRG) 및 fortified fermented red ginseng(강화발효홍삼, FFRG)으로 나누었다. 동물실험은 우석대학교 동물실험 윤리위원회의 승인(WS2013-002)을 받아 실시하였다.
- 2. 발효홍삼 시료 조제
발효홍삼(FRG)은 원료인 수삼(무주) 2 kg을 세척하여 6시간 일광건조 시킨 다음에 증숙기에 넣고 95℃에서 3시간 증숙한다. 증숙된 수삼을 3 cm 이하로 절단하여, Paecilomyces variotii var.brunneolus 배양액속에 넣고 30℃에서 48시간 발효시켰다. 발효된 수삼을 60℃ 건조기에 넣고 10시간, 그리고 50℃에서 10시간정도 건조시킨 후 수분함량이 14% 이하가 되도록 일광건조 시켰다. 강화발효홍삼(FFRG)은 원료인 수삼 2 kg을 세척하여 6시간정도 일광건조 시킨 다음에 증숙기에 넣고 95℃에서 3시간 증숙한다. 증숙된 수삼을 3 cm 이하로 절단하여, Paecilomyces variotii var.brunneolus 배양액속에 넣고 30℃에서 48시간 발효시켰다. 발효된 수삼을 건조기에 넣고 60℃에서 10시간 건조 시킨 후, 다시 증숙기에 넣고 95℃에서 3시간 2차 증숙하였다. 증숙된 수삼은 60℃ 건조기에서 10시간 그리고 50℃에서 10시간 2차 건조시킨 후 수분함량이 14% 이하가 되도록 일광건조 시켰다.
- 3. 발효홍삼 추출방법
홍삼추출기에 시중에서 판매하는 NRG와 상기 2에 기술한 방법에 의하여 제조한 FRG 및 FFRG 각각 1 kg을 물 5 L와 함께 넣고 80℃에서 8시간 중탕해서 1회 추출하고, 90℃에서 8시간동안 2회 추출 그리고 90℃에서 8시간동안 3회 추출 혼합하여 각각 15 L씩 만들었다. 각각 회수한 홍삼추출액은 여과하여 감압건조기에서 농축하고 동결건조하여 최종 수득물을 회수하였다. 회수한 시료의 무게는 NRG는 284 g, FRG는 266 g, FFRG는 268 g 이며, 사포닌 함량은 Table 1 과 같다.
Comparison of saponin contents of non-fermented red ginseng(NRG) and fortified fermented red ginseng(FFRG).
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Comparison of saponin contents of non-fermented red ginseng(NRG) and fortified fermented red ginseng(FFRG).
- 4. 시료 도포 및 투여
정상군은 아무런 처치도 하지 않았으며, 대조군은 UVB를 照射(irradiation)하고 생리식염수를 투여한 후 무시료 도포액인 기본로션(vehicle)만을 도포하였다. NRG군, FRG군, FFRG군은 홍삼 추출물의 동결건조물 300 mg을 10 ml의 증류수에 용해하여 300 mg/Kg B.W. 용량으로 1일 1회 경구 투여하였으며, 도포액은 에탄올, 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 증류수를 각각 30:20:50(v/v/v)의 비율로 혼합한 기본로션에 홍삼추출물들의 동결건조물을 2% 농도로 첨가하여 제조한 후 1일 1회 도포액 100 ㎕를 hairless 생쥐의 귀에서 등부위 전체에 도포한 후 잘 문질러 준 후 1시간 후에 UVB를 등부분에 조사(irradiation)하였다.
- 5. 실험방법
- 1) 광노화피부 유발 및 시료도포
자외선 조사장치는 실험실에서 자체 제작한 캐비넷 내에 20W Ultraviolet B(UVB) lamp를 부착한 후 조사한 광원을 UV Light meter로 측정하여 UVB 강도(intensity)가 0.3 mW/㎠가 되는 높이에서 조사하였다. 실험동물의 UVB 조사는 아크릴로 제작한 조사틀에 실험군 별로 각각의 생쥐를 가둔 후 생쥐의 등부위가 노출되도록 위쪽은 철망을 부착하였다. UVB 조사량은 최초 1주간은 1 MED(minimal erythema dose)에 해당하는 60 mJ/㎠를 1주에 3회(200초)씩 조사하였고, 2주는 120 mJ/㎠(400초), 3주는 180 mJ/㎠(600초), 4주는 240 mJ/㎠(800초)로 1주에 5회씩 조사하여 총 4주간 실시하였다.
- 2) 피부 최소홍반도 측정
피부 최소홍반도를 측정하기 위하여 20W UVB lamp에서 조사한 자외선 강도가 0.3 mW/㎠가 되도록 UV Light meter로 측정하여 조사높이를 정한 후 최소홍반량(minimal erythema dose)을 결정하였다. 이를 위해 hairless 생쥐의 등에 1x1 ㎠의 넓이로 소구획을 나눈 후 UVB를 30 mJ/㎠에서 80 mJ/㎠까지의 조사량을 10 mJ/㎠ 간격으로 조사하였다. UVB 조사 후 24시간이 경과한 후에 경계가 분명하고 네 모서리가 뚜렷한 홍반을 보이는 가장 낮은 광량인 60 mJ/㎠을 최소홍반량으로 정하였다.
- 3) 피부의 형태학적 관찰
- (1) 피부주름의 관찰
피부의 육안적인 관찰은 실험 4주째 Avertin으로 가볍게 마취를 한 후 SILFLO(Flexico developments LTD. Tokyo, Japan) silicone rubber impression material로 등쪽 피부주름의 replica를 제작하여 stereomicroscope로 촬영한 후 주름의 양상을 실험군별로 비교 관찰하였다.
- (2) 광학현미경 관찰을 위한 피부조직의 일반 및 특수염색
절취한 피부조직을 실온에서 Bouin,s solution에 24시간 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과정을 거친 다음 파라핀에 포매하고, 7 ㎛ 두께로 절편을 만들어 일반적인 조직학적 구조를 관찰하기 위하여 hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 시행하여 광학현미경으로 피부조직의 변화를 관찰하였다. 또한 특수염색으로는 진피층 내 아교섬유(collagen fiber)의 양과 형태를 광학현미경으로 관찰하기 위하여 Masson׳s trichrome 염색과 Van Gieson’s 염색 21) 을 시행하여 진피층 내의 아교섬유의 변화, 소실 및 퇴행성 변화 등을 관찰하였다. 진피층 및 피하층 내 비만세포(mast cell)의 분포양상 및 탈과립 정도를 관찰하기 위하여 toluidine blue 염색을 시행하여 광학현미경으로 관찰한 후 200배 시야에서 출현된 비만세포의 수를 개수하였다.
- (3) 피부조직의 면역조직화학적 염색
피부 조직내 사이토카인, 효소 및 수용체에 대한 면역조직화학적 변화를 관찰하고자 피부조직을 절취한 후 Bouin׳s solution에 24시간 고정한 후 일반적인 방법으로 파라핀 절편을 제작하였다. 파라핀 절편은 7 ㎛의 두께로 절단한 후 100% methanol에 0.3% H 2 O 2 를 넣은 용액에서 endogeneous peroxidase를 제거하였다. 그 후 비특이적인 면역반응을 제거하기 위하여 30분간 정상혈청(normal serum, 1:50)으로 처리하였다. UVB조사 후 변화가 있을 것으로 예상되는 mast cell tryptase(abcam, USA), proliferating cell nuclear antigen(PCNA, Santa Cruz, CA, USA), Ki-67(abcam, USA.), myeloperoxidase(abcam, USA)를 일차항체로 이용하였다. 일차항체의 희석배율은 구입한 회사에 따라 차이가 있으므로 각각의 항체에 대한 positive control test를 실시하여 적정한 항체 희석 배율을 정한 후 4℃의 moisture chamber에서 24시간 염색하였다. 2차항체는 1차항체 반응 후 5분간 3회 0.1 M PB로 수세과정을 거친 후에 Hsu 등 22) 의 방법에 따라 biotinylated anti-IgG(Vector Laboratories, Inc., CA, USA)를 1:200으로 희석한 후 실온의 moisture chamber에서 30분 동안 반응시켰다. 다시 5분간 3회 0.1 M PB 수세과정을 거친 후 peroxidase가 표지된 ABC 용액에서 30분간 반응시켰다. 그 후 다시 0.1 M PBS로 15분간 2회 수세하고 나서 30 mg의 3-3'diaminobenzidine을 50 ㎖의 0.1 M PBS에 녹인 용액에서 5분간 반응시킨 후 과산화수소를 0.005% 되게 첨가하여 갈색의 발색반응을 약 15분간 시행하였다. 반응이 끝난 조직들은 통상적인 방법에 따라 탈수와 투명화를 거친 후 permount로 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 6) 자료분석
통계적 분석은 SPSS 12.0 for windows (SPSS Inc., USA)를 이용하여 평균과 표준편차를 산출하였으며, 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 적용하였다. 각 군간 차이를 검증하기 위하여 t 검증(non-paired t-test)을 실시하였고, 통계적 유의수준은 p<0.05로 실시하였다.
결 과
- 1. 피부주름의 육안적 관찰소견
SKH-1 hairless mice의 피부주름 양상을 육안적인 광노화 피부의 지표로 사용하기 위하여 silicone rubber로 replica 모형을 제작하여 실체현미경으로 관찰한 바 UVB를 4주간 조사하면서 vehicle을 도포하고 saline을 투여한 대조군( Fig. 1 )에서는 잔주름과 깊게 패인 굵은 주름이 현저하게 관찰되었다. UVB를 4주간 조사하면서 비발효 및 발효홍삼 추출물을 4주간 투여하고, 도포한 비발효홍삼군(NRG), 발효홍삼군(FRG) 및 강화발효홍삼군(FFRG)에서는 대조군에 비하여 잔주름과 굵은 주름이 미약하게 관찰되었다( Fig. 1 ). 특히 추출조건에 따른 홍삼 추출물 투여군 간에는 FRG군에서 주름의 분포양상이 미약하게 관찰되었다.
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Photographs showing skin wrinkles of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, NRG, FRG, FFRG). The effects of NRG, FRG and FFRG treated groups showing mild increased wrinkling and some loss of fine striation on back skin compared to control group(C). Especially FRG group showing more decreased wrinkling than those of NRG and FFRG treated groups.
- 2. 피부의 일반적인 조직학적 변화 관찰
- 1) H&E stain
SKH-1 hairless mice의 피부조직을 H&E 염색하여 표피세포의 증식과 표피의 두께를 광노화 피부의 지표로 하여 관찰한 결과 UVB를 조사하지 않은 정상군(N)의 등쪽피부의 표피는 3-4층 (표피두께 39.5±4.2 ㎛)의 상피세포로 이루어졌으나( Fig. 2 ) UVB를 4주간 조사한 대조군(C)의 표피는 7-8층(표피두께 81.3±5.6 ㎛)의 상피세포로 증식되었다( Fig. 2 ). UVB를 조사하면서 4주간 비발효 및 발효홍삼 추출물을 투여하고 도포한 군을 대조군과 비교한 바 NRG군에서는 표피두께가 64.0±5.3 ㎛, FRG군에서는 표피두께 58.0±3.4 ㎛의 상피세포층으로 유의성있게(p<0.05) 감소하였으며( Fig. 3 ), FFRG군에서는 표피두께 44.5±4.5 ㎛의 상피세포층으로 대조군에 비하여 유의성있게(p<0.01) 현저히 감소하였다( Fig. 3 ). 진피층내 염증세포의 수도 대조군에 비하여 NRG군에서 대체로 감소하였으나, 특히 FRG군과 FFRG군에서 현저하게 감소하였다.
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Histological changes in the dorsal skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, NRG, FRG, FFRG) and non-irradiated normal group(N)(H&E stain, x200). The effects of red ginseng extracts treated groups showing decreased epithelial cell layers(epidermal thickness) and some loss of collagen fibers in dermis compared to control group(C). Especially FRG and FFRG treated groups showing more decreased some loss of collagen fibers in dermis than those of control group. Arrows, papillary layer of dermis.
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Changes of epidermal thickness in the skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, NRG, FRG, FFRG) and non-irradiated normal group(N). The effects of red ginseng treated groups(NRG, FRG, FFRG) showing significantly decreased epithelial cell layers(epidermal thickness) compared to control group(C). Values are mean ± SD of 5 mice. # p<0.05 compared with normal group(N); *,p<0.05 compared with control group(C), **, p<0.01 compared with control group(C).
- 2) Van Gieson׳s stain
SKH-1 hairless mice의 피부조직을 Van Gieson׳s 염색을 시행하여 표피-진피결합부위 교원섬유(collagen fibers)의 염색정도를 광노화 피부의 지표로 하여 관찰한 결과 UVB를 조사하지 않은 정상군( Fig. 4 )의 표피 밑의 진피층(특히 유두층)에서는 acid fuchsin에 강하게 염색된 교원섬유가 띠모양으로 관찰되었으나 UVB를 4주간 조사한 대조군( Fig. 4 )에서는 변성된 교원섬유가 acid fuchsin에 미약하게 염색되었다. UVB를 조사하면서 비발효 및 발효홍삼 추출물을 4주간 투여하고 도포한 군을 대조군과 비교한 바 NRG, FRG, FFRG군의 진피층의 유두층에서는 대조군에 비하여 acid fuchsin에 강하게 염색된 교원섬유가 관찰되었다( Fig. 4 ). 특히 NRG군과 FFRG군은 대조군에 비하여 acid fuchsin에 강하게 염색되었으며, FFRG군에서는 다른 군에 비하여 염증 세포의 침윤이 현저히 감소하였다( Fig. 4 ).
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Histological changes in the skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, NRG, FRG, FFRG) and non-irradiated normal group(N)(Van Giesson׳s stain, x200). The effects of red ginseng treated groups(NRG, FRG, FFRG) showing increased staining intensity of collagen fibers within papillary layer of dermis compared to control group(C). Especially FFRG and NRG treated groups showing more increased staining intensity of collagen fibers in dermis than those of FRG group. FFRG treated group showing infiltration of neutrophils was more decreased in dermis than those of other groups. Arrows, acid fuchsin stained collagen fibers; Arrows, dermal papillary layer.
- 3) Masson׳s trichrome stain
Masson׳s trichrome염색을 시행하여 교원섬유를 관찰한 결과 UVB를 조사하지 않은 정상군( Fig. 5 )에서는 표피 밑의 진피층(특히 유두층)에서는 aniline blue에 강하게 염색된 교원섬유가 관찰되었으나 UVB를 4주간 조사한 대조군( Fig. 5 )에서는 변성된 교원섬유가 aniline blue에 미약하게 염색되었다. UVB를 조사하면서 비발효 및 발효홍삼 추출물을 4주간 투여하고 도포한 군을 대조군과 비교한 바 NRG, FRG, FFRG군의 진피층의 유두층에서는 대조군에 비하여 aniline blue에 강하게 염색된 교원섬유가 관찰되었다. 특히 FFRG군은 NRG군과 FRG군에 비하여 aniline blue에 강하게 염색되었다( Fig. 5 ).
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Histological changes in the skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, NRG, FRG, FFRG) and non-irradiated normal group(N)(Masson׳s trichrome stain, x200). The effects of red ginseng treated groups showing increased collagen fibers within papillary layer of dermis compared to control group(C). Especially NRG and FFRG treated group showing more increased staining intensity of collagen fibers in dermis than those of NRG and FRG groups. Arrows, Aniline blue stained collagen fibers; Arrows, dermal papillary layer.
- 4) 피부 비만세포의 수적 변화 관찰
SKH-1 hairless mice의 등의 피부조직을 toluidine blue 염색을 시행하여 비만세포의 숫적변화를 관찰한 결과 UVB를 조사하지 않은 N군의 등쪽 피부의 진피층내 비만세포는 21.7±5.2개가 관찰되었으나 UVB를 4주간 조사한 C군의 진피층내 비만세포는 37.3±2.4개로 정상군에 비하여 유의성있게(p<0.05) 증가하였다. UVB를 조사하면서 비발효 및 발효홍삼 추출물을 4주간 투여하고 도포한 군을 대조군과 비교한 바 NRG군에서는 24.4±3.4개로 대조군에 비하여 유의성있게(p<0.05) 감소하였고, FRG군과 FFRG군에서는 각각 17.8±3.6, 16.6±3.6개로 대조군에 비하여 유의성있게(p<0.01) 감소하였다( Fig. 6 ).
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Numerical changes of mast cells in the dorsal skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, NRG, FRG, FFRG) and non-irradiated normal group(N). The effects of NRG, FRG, FFRG) treated groups showing significantly decreased toluidine blue stained mast cells within dermis compared to control group(C). Each values are mean ± SD of 5 mice. # p<0.05 compared with normal group(N); * p<0.05 and ** p<0.01 compared with control group(C).
- 3. 피부의 면역조직화학적인 변화 관찰
- 1) Mast cell tryptase에 대한 면역염색 반응
SKH-1 hairless mice의 피부조직내 진피층의 비만세포내 분비과립을 관찰하기 위하여 mast cell tryptase 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. Mast cell tryptase에 의하여 발현된 비만세포는 UVB를 조사하지 않은 정상군(N)( Fig. 7 )의 진피층에서는 소수의 세포들이 미약하게 발현되었으나 UVB를 4주간 조사한 대조군(C)( Fig. 7 )의 진피층에서는 N군에 비해 다수의 세포들이 정상군에 비하여 강한 면역반응을 나타내었다. UVB를 조사하면서 비발효 및 발효홍삼 추출물을 4주간 투여하고 도포한 군에서는 대조군보다는 숫적으로 감소하였고, 면역염색 반응도 정상군과 유사하게 미약하게 발현되었다( Fig. 7 ).
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Immunohistological changes of mast cell tryptase in dorsal skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, NRG, FRG, FFRG) and non-irradiated normal group(N)(mast cell tryptase immunohistochemical stain, x200). The effects of red ginseng treated groups showing decreased immunoreacted mast cells within dermis compared to control group(C). Arrows, Immunoreacted mast cells; Arrows, mast cell tryptase immunoreacted cells.
- 2) Proliferating cell nuclear antigen(PCNA)에 대한 면역염색 반응
SKH-1 hairless mice의 피부조직의 표피 상피세포의 분열상태를 관찰하기 위하여 증식세포핵항원(PCNA)항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. PCNA의 발현은 UVB를 조사하지 않은 정상군(N)( Fig. 8 )의 표피 상피세포층에서는 기저층 한층에서만 발현되었으나 UVB를 4주간 조사한 대조군(C)( Fig. 8 )의 표피 상피세포층에서는 N군에 비해 비교적 기저층 뿐만아니라 여러 층에서 강하게 발현되었다. UVB를 조사하면서 비발효 및 발효홍삼 추출물을 4주간 투여하고 도포한 군을 대조군과 비교한 바 NRG군과 FFRG군에서는 대조군이나 FRG군에 비하여 미약하게 기저층 한층에서만 발현되었다( Fig. 8 ).
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Immunohistological changes of PCNA in skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, NRG, FRG, FFRG) and non-irradiated normal group(N)(PCNA immunohistochemical stain, x200). The effects of NRG and FRG treated groups showing reduced PCNA expression within epidermis compared to control(C) and FRG treated group(FRG); Arrows, PCNA immunoreacted cells.
- 3) Ki-67에 대한 면역염색반응
SKH-1 hairless mice의 피부조직의 광노화 피부와 관련된 Ki-67의 변화를 관찰하기 위하여 Ki-67 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. Ki-67의 발현은 UVB를 조사하지 않은 정상군(N)( Fig. 9 )의 진피층에서는 미약하게 발현되었으나 UVB를 4주간 조사한 대조군(C)( Fig. 9 )의 진피층에서는 N군에 비해 비교적 강하게 발현되었다. UVB를 조사하면서 비발효 및 발효홍삼 추출물을 4주간 투여하고 도포한 NRG군, FRG군 및 FFRG군의 진피층에서는 대조군(C)에 비해 미약하게 발현되었다( Fig. 9 ). 실험군간에는 FFRG군이 다른 군에 비하여 가장 미약하였으며, 그 다음으로는 FRG군이 미약하게 발현되었다.
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Immunohistological changes of ki-67 in skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, NRG, FRG, FFRG) and non-irradiated normal group(N)(Ki-67 immunohistochemical stain, x200). The effects of FRG and FFRG treated groups showing reduced Ki-67 expression within skin compared to control(C) and NRG groups.
- 4) Myeloperoxidase에 대한 면역염색반응
SKH-1 hairless mice의 피부조직의 광노화 피부와 관련된 myeloperoxidase의 변화를 관찰하기 위하여 myeloperoxidase 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. Myeloperoxidase의 발현은 UVB를 조사하지 않은 정상군(N)( Fig. 10 )의 진피층에서는 미약하게 발현되었으나 UVB를 4주간 조사한 대조군(C)( Fig. 10 )의 진피층에서는 N군에 비해 비교적 강하게 발현되었다. UVB를 조사하면서 비발효 및 발효홍삼추출물을 4주간 투여하고 도포한 NRG군, FRG군 및 FFRG군의 진피층에서는 대조군(C)에 비해 미약하게 발현되었다( Fig. 10 ). 실험군간에는 FFRG군이 다른 군에 비하여 가장 미약하게 발현되었다.
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Immunohistological changes of myeloperoxidase in skin of SKH-1 mice exposed to 4 weeks of UVB irradiated experimental groups(C, NRG, FRG, FFRG) and non-irradiated normal group(N)(myeloperoxidase immunohistochemical stain, x200). The effects of FFRG treated groups showing reduced myeloperoxidase expression within skin compared to control(C), NRG NRG, FRG groups.
고 찰
피부노화는 온도, 습도, 매연 및 기계적인 자극과 같은 외부환경 인자에 항상 노출되기 때문에 다른 기관의 노화와는 차이가 있으며, 이들 인자 중 자외선이 피부에 가장 많은 영향을 미치고 있다 23 - 25) .
자외선은 파장의 종류에 따라 피부에 침투하는 부위에 차이가 있는데 UVB(280-320 nm)는 대체로 표피에서 흡수되므로 표피상피(각질세포)에 영향을 미치며, UVA(320-400 nm)는 보다 심층부위에 침투하므로 표피의 각질세포와 진피의 섬유아세포에 영향을 미친다 26) . 짧은 파장의 UVB는 홍반, 주름 및 피부암과 같은 광손상을 야기하고, UV에 의한 활성산소종을 생성하여 아교질, 탄성질, 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycans)과 같은 세포외기질의 구조적 또는 기능적인 변화를 초래하며, 세포구성 성분인 DNA, 단백질 및 지질의 변성을 초래한다 27) .
피부 노화는 아교질의 합성과 분해정도에 따라 주름이 생기고 탄력을 잃는데, 이는 진피층에 있는 기질 단백질인 아교질의 결핍에 의하여 발생한다. 피부가 자외선에 노출되면 진피층의 섬유아세포에서 아교질의 생산이 감소하고, 기질금속 단백질 분해효소인 matrix metalloproteinases(MMPs)의 발현이 증가하여 기질 단백질의 분해가 증가된다는 것이 밝혀짐으로써, 자외선이 피부 노화의 주원인으로 알려져 있다 6 , 7 , 28) .
최근에는 피부노화 억제와 치료를 위한 많은 연구가 진행되고 있으며, 피부에 부작용이 적은 천연소재에서 생리활성 물질을 찾기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
본 연구에서는 홍삼의 광노화피부 개선 효과를 관찰하기 위하여 기능성이 강화된 홍삼을 개발하기 위한 연구의 일환으로 발효공정을 개선하여 Table 1 과 같이 사포닌 성분을 강화시킨 홍삼에서 추출한 추출물들을 이용하였다. 본 실험에서는 광노화 피부의 개선 효과를 hairless mice를 이용하여 자외선에 의한 광노화 피부 억제인자들을 형태학적 및 분자생물학적으로 관찰하였다. 홍삼은 수삼을 증숙한 후에 건조하여 제조한 갈색의 인삼을 말하는 것으로 그 기본 효능은 인삼과 유사하다. 인삼( Panax ginseng C.A. Meyer)은 Panax屬에 속하는 고려인삼을 의미하지만 현재에는 고려인삼 외에도 회기삼( Panax quiquefolius L.), 전칠삼( Pananx notoginseng F.H. Chen), 죽절삼( Panax japonicus C.A. Meyer), 삼엽삼( Panax trifolium L.), 히말라야삼( Panax pseudoginseng Wall) 등 五加科(Araliaceae)에 속하는 많은 다년생 초본들에 두루 사용되고 있다 29) .
인삼의 효능은 한의학적 기미론(氣美論)에 근거하여 漢代의 神農本草經에서는 甘, 微寒하다고 하였으나 唐代의 新修本草에서는 甘, 微寒微溫으로 기술하였고 金元時代의 張元素는 微苦, 溫으로 보았으며 明代의 本草綱目에서는 다시 甘, 微寒이라고 하였다 30) . 또 東醫寶鑑의 湯液篇에서는 인삼의 기미를 甘(一云味苦), 微溫(一云溫)하다고 하였는데 이처럼 인삼의 기미에 대하여 諸家의 학설이 다양한 것은 인삼의 효능이 그만큼 다각적이라는 것을 의미한다 31) .
인삼의 효능에 대하여 東醫寶鑑에서는 인삼이 오장의 氣가 부족한 것을 다스리며 정신을 안정시키고 눈을 밝게 하며 심규를 열어주고 기억력을 좋게 하며 허손된 곳을 보하여 치료하고 속이 뒤틀려 토하고 딸국질하는 것을 멎게 하며 폐병으로 고름을 뱉는 것을 치료하고 가래를 삭힌다(主五臟氣不足, 安精神, 定魂魄, 明目, 開心益智, 療虛損, 止霍亂嘔噦, 治肺痿吐膿, 消痰)라고 하였다 31) . 東醫寶鑑이나 기타의 의서에 언급된 인삼의 효능을 기미론에 비추어 정리해보면 인삼은 補氣, 補陽, 補脾(소화력 강화) 등 甘溫의 성질과 沈靜, 養血, 補陰, 消炎등 苦微寒의 성질을 두루 갖추고 있다고 볼 수 있다 32) .
인삼은 신경 활동의 기민성을 개선시킴으로써 수면과 정서를 안정시키기 때문에 작업능력을 향상시키고 피로를 감소시키는 것으로 알려져 있다 33 , 34) . 인삼에 포함된 인삼 배당체(glycoside)는 항스트레스 작용이 있으며 32) 외부 자극에 대한 방어 능력을 높이는 것으로 보고되고 있다 35 , 36) . 인삼은 또한 强心작용으로 부정맥 등 심장기능 이상을 호전시키며 인체의 신진대사를 촉진함으로써 혈중당과 혈중 콜레스테롤을 낮추는 작용을 한다 37 - 39) . 그 외에 소화와 흡수를 촉진하고 40) 혈압을 낮추며 41 , 42) 성선자극호르몬의 분비를 촉진시켜 성기능을 회복시키는 효능이 있는 것으로 알려지고 있다 43) . 인삼은 고혈압, 협심증 등 심혈관계통 질환, 만성 위염 등의 소화기 계통 질환, 당뇨병, 우울증과 신경 쇠약 등의 정신신경과 질환, 음위나 정력감퇴 등의 질환에 두루 이용되고 있다 33) .
홍삼은 사용 기간을 증가시키기 위해 인삼을 쪄서 말린 것이지만 기미론으로 볼 때 인삼의 性을 더욱 甘溫하게 함으로써 補益性의 면을 강화시킨 것이라고 볼 수 있다. 따라서 甘溫의 효능이 필요한 곳에서 인삼을 生用하는 것보다 더 유효한 효과가 나타날 것임을 추론할 수 있다 31) . 성분의 측면에서 보았을 때 인삼을 홍삼으로 수치하는 과정에서 수삼 또는 백삼과 다른 유효성분이 생성되는 것으로 알려져 있다 44) . 즉 대표 성분인 인삼사포닌(ginsenoside)의 구성에서 수삼의 경우는 Rb1, Rg1, Re 등이 많이 함유된 반면 홍삼은 증숙과정에서 물리적으로 만들어진 Rh3가 가장 많고 다음이 Rg1과 Rh2의 순서이다 29) . 홍삼은 인삼과 마찬가지로 고혈압, 당뇨병, 암 및 통증 등에 대한 다양한 효과가 있다고 보고되고 있으며 45) , 임상적으로는 화농성 아토피 피부염, 화상 및 피부염 등에 사용되어왔다 46) .
최근에는 김치에서 분리 배양한 유산균을 이용하여 홍삼을 발효시켜 고분자 사포닌 성분(Rg1, Rh1, Rb1, Rb2)은 감소시키고 저분자의 대사체 사포닌(Rh1, Rg3, Rg5+Rk1 등)을 증강시킨 홍삼 추출물에 대한 연구가 보고되었고 42) , 특히 저분자화 된 ginsenoside들은 장내 미생물에 의하여 전환되어 장내 흡수율을 높여준다고 하였다 46) . 본 연구에서는 발효공정을 이용하여 기존의 사포닌 성분을 강화시킨 발효홍삼 추출물들과 미발효 홍삼추출물을 이용하여 광노화 피부의 개선효과를 비교 관찰하고자 하였다.
진피는 아교섬유와 탄성섬유로 구성되었으며, 아교섬유는 진피의 주요 성분으로서 피부에 장력과 구조적인 통합을 이루게 하고 47) , 탄성섬유는 일부 구성성분을 이루고 있지만 피부에 탄력을 준다. 피부노화는 조직학적으로 섬유아세포의 수적감소 및 아교질과 elastin의 양이 감소되면서 세포외기질이 위축된 것을 말한다 48 - 50) . 본 실험에서 피부주름 양상을 광노화 피부의 지표로 사용하여 관찰한 바 비발효 홍삼군(NRG), 발효 홍삼군(FRG) 및 강화발효 홍삼군(FFRG)에서는 대조군에 비하여 잔주름과 굵은 주름이 미약하게 관찰되었으며 특히 FRG군에서는 주름의 분포양상이 미약하게 관찰되었다. 표피두께도 NRG군에서는 표피두께가 64.0±5.3 ㎛, FRG군에서는 표피두께 58.0±3.4 ㎛의 상피세포층으로 대조군에 비해 유의성있게(p<0.05) 감소하였으며, 특히 FFRG군에서는 표피두께 44.5±4.5 ㎛의 상피세포층으로 대조군에 비하여 유의성있게(p<0.01) 현저히 감소하였다. 본 실험에서 Masson׳s trichrome 염색과 Van Gieson׳s 염색에 의한 아교섬유의 변화를 관찰한 바 NRG, FRG, FFRG군에서는 대조군에 비하여 진피층의 유두층에서 acid fuchsin과 aniline blue에 강하게 염색된 아교섬유가 관찰되는데 특히 NRG군과 FFRG군은 대조군에 비하여 acid fuchsin에 강하게 염색되었고 FFRG군은 NRG군과 FRG군에 비하여 aniline blue에 강하게 염색되어 강화발효 홍삼 추출물이 비발효홍삼과 발효홍삼추출물에 비해 표피-진피 결합부위에서 아교섬유 단백질의 분해, 항염작용, 표피상피세포 증식을 억제하여 광노화피부의 주름을 개선한 것으로 사료되었다. 이러한 결과는 Kim 등 51) 의 보고와 일치하는데, Kim 등은 홍삼추출물이 UVB 자극에 의하여 유도된 피부내 TGF-β1의 증가를 억제하여 피부노화를 방지하며, 이는 홍삼추출물의 총사포닌(total saponin)과 Rb1이 만성적인 UVB자극에 의한 아교섬유의 파괴를 억제한다고 하였다 13) .
UVB(290-320 nm) 자극 후 일어나는 부종 및 홍반과 같은 급성염증은 피부의 비만세포에서 분비하는 히스타민이 중요한 매개 기능을 한다 52) . 사람의 피부에 자외선을 자극하면 비만세포 탈과립에 의하여 혈관주위에 부종과 홍반(erythema)이 나타난다 53) . 비만세포 탈과립에 의하여 방출된 히스타민은 피부 비만세포의 주요 생체아민(biogenic amines)으로서 홍반반응시 중요한 기능을 하며 54) , 히스타민은 UVB에 의한 전신성 면역조절을 개시하기 위한 경로에서 결정적인 역할을 한다 55) .
UVB 자극에 의하여 비만세포가 활성화되면 미리 형성된 많은 양의 TNF-α를 방출하여 피하층 내피세포에 대한 CD54와 CD62E 부착분자를 유도한다 56) . 진피에 있는 혈관의 활성화와 자극된 피부로 염증세포의 이동을 증가시켜 햇빛으로 인한 화상에 반응하고, 또한 TNF-α는 UV가 자극된 피부에서 림프절로 랑거한스세포(Langerhans cells)의 이주를 조절한다 57) . 탈과립된 히스타민은 각질세포에 영향을 미칠 뿐만아니라 직접 UV가 조사된 부위 58) 또는 인접한 림프절로 면역세포를 이동시켜 림프구 증식과 여러 가지 사이토카인의 방출을 조절한다 59) . 본 실험에서 비만세포의 수적 변화는 NRG군에 비해 FRG군과 FFRG군에서는 각각 17.8±3.6, 16.6±3.6개로 대조군에 비하여 유의성있게(p<0.01) 감소하였다. Mast cell tryptase에 의하여 발현된 비만세포도 대조군보다는 수적으로 감소하였으며, 면역염색 반응도 정상군과 유사하게 미약하게 발현되어 발효홍삼 추출물은 광노화 피부에 대한 개선효과가 있음을 알 수 있었다.
Proliferating marker인 Ki-67(nuclear antigen)은 세포주기 중 G1, S, G2 및 M phases에 발현되며, proliferating cell nuclear antigen(PCNA)는 neoplastic cell 또는 non-neoplastic cell의 late G1과 S phase의 핵에서 특이적으로 발현된다 60) . 본 실험에서 Ki-67에 대한 면역염색 반응은 UVB를 조사하면서 비발효 및 발효홍삼 추출물을 4주간 투여하고 도포한 NRG군, FRG군 및 FFRG군의 진피층에서는 대조군에 비해 미약하게 발현되었으며, 실험군간에는 FFRG군, FRG군 순서대로 대조군에 비하여 미약하게 발현되었다. PCNA에 대한 면역염색 반응은 NRG군과 FFRG군에서 대조군과 FRG군에 비하여 미약하게 기저층 한층에서만 발현되어 만성적인 UVB자극에 의하여 각질세포 증식과 표피이상증식에 의한 피부 기저층(stratum basale)내 Ki-67 양성세포가 증가한다는 보고 13) 및 항산화 기능과 항염작용이 있는 석류추출물의 UVA에 대한 Ki-67의 발현억제에 대한 결과 61) 에 따라 비발효 및 발효홍삼 추출물들은 UVB 자극에 의한 표피세포 증식에 대한 조절 효과가 있을 것으로 사료되었다.
UVB 자극에 의하여 myeloperoxidase 양성반응을 나타내는 진피층의 세포들이 빠르게 증가하는 것은 UVB에 의하여 생성된 hydrogen peroxide를 불활성화 하거나 peroxidation reaction을 증가시켜 UVB에 대한 세포반응을 개시하기 위함이다 62) . Myeloperoxidase 활성의 증가는 potent oxidizing agent인 hypochlorous acid (HOCl 2 )의 생성이 증가하는 것과 같으며, 이 물질의 증가는 DNA나 다른 세포 성분의 산화가 증가한 것으로 생각하고있다 63) . 생쥐의 피부에서 UVB에 의한 myeloperoxidase가 증가하는 이유는 염증반응과 관련이 있다고 하였다 64) . 본 실험에서 myeloperoxidase에 대한 면역반응은 UVB를 4주간 조사한 대조군의 진피층에서는 정상군에 비해 비교적 강하게 발현되었다. UVB를 조사하면서 비발효 및 발효홍삼 추출물을 투여하고 도포한 NRG군, FRG군 및 FFRG군의 진피층에서는 대조군에 비해 미약하게 발현되었다. 실험군간에는 FFRG군이 다른 군에 비하여 가장 미약하게 발현되어 비발효 및 발효홍삼 추출물은 UVB에 의한 피부 염증반응을 억제할 것으로 사료되었다.
이상의 실험 결과로 비발효 및 발효 홍삼추출물들은 UVB에 의한 광노화 피부의 개선에 효과가 있을 것으로 사료되었고, 미발효 홍삼에 비해 발효와 강화발효 홍삼 추출물이 더욱 효과적인 것으로 사료되었다. 이 후에는 사포닌 성분에 따른 광노화피부 개선 효과를 심층적으로 연구하여야 할 것으로 사료되었다.
결 론
미생물 발효에 의하여 사포닌 성분을 강화시킨 발효홍삼을 이용하여 광노화 피부개선 효과를 관찰하기 위하여 hairless mice에 투여하고 도포한 후 광노화 피부억제와 관련된 인자들에 미치는 영향을 형태학적으로 관찰한 바 다음과 같은 결과를 얻었다.
피부주름의 육안적인 변화는 NRG군, FRG군 및 FFRG군에서는 대조군에 비하여 잔주름과 굵은 주름이 미약하게 관찰되었으며, 특히 FRG군에서 주름의 분포양상이 미약하게 관찰되었다. 표피세포의 증식에 의한 표피의 두께변화는 NRG군과 FRG군(p<0.05) 및 FRG군(p<0.01)에서는 대조군에 비하여 유의성있게 감소하였으며, 진피층내 염증세포의 수는 FRG군과 FFRG군이 대조군에 비해 현저하게 감소하였다. Masson׳s trichrome염색과 Van Gieson׳s 염색에 의한 교원섬유의 염색성은 NRG, FRG, FFRG군의 진피층의 유두층에서는 대조군에 비하여 acid fuchsin과 aniline blue에 강하게 염색되었으며, 특히 FFRG군은 다른 실험군에 비하여 더욱 강한 염색성을 나타내었다. 비만세포의 숫적변화는 NRG군에서는 24.4±3.4개로 대조군에 비하여 유의성있게(p<0.05) 감소하였고, FRG군과 FFRG군에서는 각각 17.8±3.6, 16.6±3.6개로 대조군에 비하여 유의성있게(p<0.01) 감소하였다. 면역조직화학 염색법에 의한 Mast cell tryptase에 의하여 발현된 비만세포는 NRG, FRG, FFRG군이 대조군에 비하여 숫적으로 감소하였고, 면역염색 반응도 미약하게 발현되었다. 증식세포핵항원(PCNA) 항체를 이용한 표피 상피세포의 분열상태는 NRG군과 FFRG군이 대조군과 FRG군에 비하여 미약하게 기저층 한층에서만 발현되었고, Ki-67의 발현은 NRG군, FRG군 및 FFRG군의 진피층에서는 대조군에 비해 미약하게 발현되었다. 실험군간에는 FFRG군이 다른 군에 비하여 가장 미약하게 발현되었다. Myeloperoxidase의 발현은 NRG군, FRG군 및 FFRG군의 진피에서 대조군에 비해 미약하게 발현되었으며, 실험군간에는 FFRG군이 다른 군에 비하여 가장 미약하게 발현되었다.
이상의 실험 결과로 미생물에 의한 발효홍삼 및 강화발효 홍삼추출물은 미발효 홍삼추출물에 비하여 UVB에 의한 피부노화 인자들의 활성을 더욱 억제 할 것으로 사료되었으므로 광노화에 의한 피부손상을 예방하는 생리활성을 이용한 기능성 소재로 활용이 가능할 것으로 판단된다.
Acknowledgements
이 논문은 2014년도 우석대학교 LINC사업단 연구비 지원에 의해 수행되었으며, 이에 감사드립니다.
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