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Single-Dose Oral Toxicity Test of Woohwangchungshim-won in Mice
Single-Dose Oral Toxicity Test of Woohwangchungshim-won in Mice
Journal of Physiology & Pathology in Korean Medicine. 2014. Apr, 28(2): 186-194
Copyright © 2014, The Korean Association of Oriental Medical Physiology
  • Received : January 23, 2014
  • Accepted : March 31, 2014
  • Published : April 25, 2014
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About the Authors
제원 이
경민 백
kmb1004@hanmail.net
우석 장

Abstract
The object of this study was to obtain acute toxicity information (single-dose oral toxicity) of Woohwangchungshim-won (WHCSW), a pill type herbal medicine used in Korean Medicine (KM) for treating stroke. In order to obtain the 50% lethal dose (LD50), approximate lethal dosage (ALD) and target organs, WHCSW powders were once orally administered to female and male ICR mice at dose levels of 2,000, 1,000, 500 and 0 (control) ㎎/㎏ (body weight.) according to the recommendation of Korea Food and Drug Administration (KFDA) Guidelines (Notification No. 2009-116). The mortality and changes in the body weight, clinical signs and gross observation were monitored for 14 days after single-dose oral administration of WHCSW according to KFDA Guidelines with organ weights and histopathological changes were observed in 12 principle organs. After single-dose oral administration of WHCSW, we could not find any mortality and toxicological evidences up to 2,000 ㎎/㎏-administered group, except for some accidental findings and dose-independent increases of body weight gains in female 1,000 and 500 ㎎/㎏ -administered female mice. The results obtained in this study suggest that the LD50 and ALD of WHCSW in both female and male mice after single-dose oral administration were considered as over 2,000 ㎎/㎏ because no mortalities were detected up to 2,000 ㎎/㎏ that was the highest dose recommended by KFDA and Organization for Economic Co-Operation and Development (OECD), and can be safely used in clinics.
Keywords
서 론
우황청심원은 太平惠民和劑局方 1) 에 최초로 기재된 처방으로 약성은 凉하고 五臟六腑에 모두 歸經하며, 淸血瀉火, 解毒作用을 하며, 開竅化痰, 養血生津하는 효능이 있어 2 , 3) , 중풍의 구급약 뿐만 아니라 심·뇌혈관계 및 신경계질환에 응용되고 있는 약물이다. 국내에서는 東醫寶鑑에 수록된 우황청심원의 처방 구성 약물 중 朱砂, 石雄黃과 같은 광물성 생약과 수입이 금지된 犀角을 제외하고 丸으로 만든 다음, 金箔을 입혀 심·뇌혈관계 및 신경계질환에 사용하고 있으며, 복용을 편리하게 하고 소화흡수를 촉진시키기 위한 현탁액 제제도 생산 및 유통되고 있다 4) .
우황청심원의 심·뇌혈관계 및 신경계 관련 연구로는 뇌혈류 개선효과 5 , 6) , 뇌 신경 보호효과 7 , 8) , 혈압강하 효과 9 , 10) , 학습 및 기억장애 개선효과 11) 등이 있다. 우황청심원은 금박을 포함한 총 28가지에 해당하는 많은 약재로 구성되어 있으며, 안전성에 관한 문제로서 마우스에서 예비 급성 독성실험 12) , 랫트에서 급성 및 아급성(30일 연속 경구투여) 간독성 실험이 진행되었으나 13) , 뚜렷한 독성 증상은 보고된 바 없었다. 우황청심원에 대한 독성시험은 주로 약학대학 및 제약회사를 주축으로 1990년대 중후반에 많이 이루어졌으나 이후에는 독성시험이 실시되지 않았다. 한방병원에서 일반적으로 사용되고 있는 朱砂, 石雄黃및 犀角을 제외한 우황청심원에 대한 독성시험은 현재까지 이루어지지 않았으며, 현재 사용되고 있는 한국식품의약품안전청(KFDA) 고시 제2009-116호 “의약품 등의 독성시험기준”에 명시되어 있는 독성시험은 수행된 바 없다 4 , 14) . 따라서 우황청심원의 일반 독성시험 중 마우스 경구 단회투여독성 시험을 실시하여, 장기투여 독성 시험과 생식 · 발생독성 시험을 위시한 특수 독성시험에 대한 기초자료 제공 및 우황청심원에 대한 유효성 평가, 임상적 유효용량 설정 및 적정 투여용량, 최대 용량 설정을 위한 연구에 근거를 제공하기 위하여 본 연구를 진행하였다.
본 실험에서는 반수치사율(50% lethal dose, LD50), 개략적 치사량(approximate lethal dosage; ALD), 최대 내성 용량(maximum tolerance dosage; MTD) 및 표적장기(target organ)를 산출하기 위하여, 한국식품의약품안전청 고시 14) 에 따라 우황청심원 2,000, 1,000 및 500 ㎎/㎏을 단회 경구 투여한 다음 14일간 체중 및 임상증상을 관찰하였으며, 14일 후 최종 부검을 통하여 12개의 주요 장기에 대한 장기 중량 측정, 육안 부검 및 조직병리학적 검사를 각각 실시하여 유의한 결과를 얻어 보고 하고자 한다.
재료 및 방법
본 실험에서 모든 실험동물은 대구한의대학교 실험동물윤리위원회의 기준에 준하여 취급하였다.
- 1. 실험동물 및 사육관리
암수 각 20마리의 ICR 마우스(6-week old upon receipt, SLC, Japan; ANNEX I~III)를 8일간의 순화과정을 거쳐 실험에 사용하였으며, 순화과정 및 실험 전 기간동안 온도(20~24℃)와 습도(48~52%)가 조절된 사육실에서 마우스용 polycarbonate 사육 상자에 5마리씩 수용하여 사육하였고, 명암 주기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였으며, 사료(Samyang, Korea)와 음수는 자유롭게 공급하였다. 모든 실험동물은 투여일 및 최종부검일 18시간 전 절식을 실시하였으며(이 기간에도 음수는 자유롭게 공급하였다), picric acid로 개체를 식별하였다.
- 2. 우황청심원
본 실험에 사용된 우황청심원은 대구한의대학교 부속 대구한방병원에서 제조, 처방되는 제품을 사용 하였으며, 본 실험에 사용된 우황청심원 1환(5 g/pill) 분량의 조성은 Table 1 과 같다. 우황청심원 5환(25 g)을 전기 미세분쇄기(Sungchang Machine Co., Sungnam, Korea)로 세말하여, 진갈색의 분말을 얻어 실험에 사용하였다. 준비한 우황청심원 세말 분말은 -20℃의 냉동 보관 후 실험에 사용하였으며, 본 실험에서 사용한 용매인 증류수에 100 ㎎/㎖의 농도까지 비교적 잘 현탁되었다.
Composition of WHCSW Used in This Study
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WHCSW, Woohwangchungshim-won. WHCSW was obtained from Daegu Oriental Hospital, Daegu Haany University.
- 3. 군분리 및 약물 투여
실험동물은 군당 5마리씩 Table 2 에 기록한 8그룹으로 구분하였다. 기존에 수행된 7일간의 예비 독성 실험 12) 및 간 독성에 대한 랫트 급성 및 아급성 독성 실험 13) 에서, 뚜렷한 독성 증상이 나타나지 않았다. 그래서 본 연구에서는 한국식품의약품안전청 고시 제2009-116호 14) 와 OECD 실험기준 #423 15) 에 의거하여, 설치류 최고 한계투여용량인 2,000 ㎎/㎏을 최고 용량으로 설정하였으며, 공비 2로 1,000 및 500 ㎎/㎏을 중간 및 저용량 투여군으로 설정하였다. 또한 암수 각각에 대한 매체 대조군(vehicle)을 추가 하였다. 모든 투여군에서는 우황청심원 세말 분말을 멸균 증류수에 현탁시켜 20 ㎖/㎏의 용량으로 overnight 절식(대략 18시간, 음수는 제한하지 않음) 후 존데(sonde)가 부착된 1 ㎖주사기를 이용하여 경구 투여하였다. 식이와 음수에 따른 약물의 흡수 변화를 최소화하기 위해, 투여 후 대략 3시간 동안 사료와 음수 공급을 제한하였다.
Experimental Design Used in This Study
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* Vehicle control; distilled water 20 ㎖/㎏ as vehicle in this study WHCSW, Woohwangchungshim-won All test articles in vehicle were once orally administered in a volume of 20 ㎖/㎏, dissolved in distilled water.
- 4. 임상증상 관찰
모든 실험동물의 임상증상을 투여 전후에 각각 Functional Observational Battery Test 16 , 17) 를 기초하여 동물의 행동, 자극에 대한 반응성, 각성도 및 경계성, 자세 및 보행 이상 등에 관한 일반증상을 관찰, 기록하였으며, 투여일 이후에도 하루에 최소한 2번씩 모든 실험동물의 임상증상을 관찰, 기록하였다.
- 5. 체중 측정
모든 실험동물의 체중을 투여전 1일, 투여직전, 투여 후 1, 2, 7, 13 및 14일(최종 희생일)에 각각 측정하였으며, 투여일~투여 후 7일, 투여 후 7일~13일 및 투여일~투여 후 14일간의 체중증가량을 각각의 체중을 이용하여 산출하였다.
- 6. 육안부검
투여 14일 후 모든 실험동물은 overnight 절식(대략 18시간, 음수는 제한하지 않음)을 실시하였으며, ethyl ether(덕산 공업주식회사, Korea) 마취하에 부검을 실시하고, 아래의 주요 장기를 위주로 이상 육안소견을 각각 관찰, 기록하였다.
육안 부검시 관찰한 주요장기는 폐, 흉선, 부신, 심장, 신장, 비장, 고환, 전립선, 간, 췌장, 부고환, 악하임파절, 난소, 뇌, 피부, 소화관, 기도, 난관 및 자궁이었다.
- 7. 장기 중량 측정
모든 실험동물은 육안부검 소견을 관찰 기록한 후 아래의 장기에 대한 절대 중량을 각각 측정하였으며, 체중 변화에 수반된 이차적 변화를 최소화하기 위해 체중에 대한 각각의 장기 절대중량의 비율인 상대 중량을 산출하였다.
폐, 심장, 흉선, 좌측 신장, 좌측 부신, 비장, 좌측 고환, 간, 췌장 비장엽, 좌측 부고환, 좌측 악하임파절, 좌측 난소, 뇌 및 자궁의 무게를 측정하였다.
- 8. 조직병리학적 관찰
아래의 12개 주요 장기의 일부 조직을 10 % 중성포르말린에 18시간 이상 고정시킨 다음, 탈수를 거쳐 파라핀 포매 후 4 ㎛의 절편을 제작하였다. 이후 hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 실시하고, 광학현미경 하에서 이상 유무를 관찰, 기록하였다.
폐, 심장, 흉선, 좌측 신장, 좌측 부신, 비장, 좌측 고환, 간, 췌장 비장엽, 좌측 부고환, 좌측 악하임파절, 좌측 난소, 뇌 및 자궁의 조직에 대한 병리학적인 소견을 관찰 하였다.
- 9. 통계처리
모든 수치는 ‘평균±표준편차’로 표시하였으며, 다중비교검증을 이용하여 통계처리를 실시하였고, 분산 동질성을 Levene test를 실시하여 검증하였다. 등분산일 경우, one way ANOVA test를 실시한 다음 Scheffe test로 사후 검증을 실시하여 군간의 유의성을 측정하였다. 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal-Wallis H test를 실시하여 유의성이 있는 경우에는, Mann-Whitney U (MW) test를 실시하여 군간의 유의성을 검증하였다. 단회 투여독성시험의 경우, 반수치사량 및 95% 신뢰한계(confidence limits)를 Probit 방법으로 측정하였으며, 임상 증상, 육안부검 및 조직병리학적 소견은 각각 그 정도에 따라 0 (normal), 1+ (slight), 2+ (moderate) 및 3+ (severe)로 구분하였다. 통계처리 및 Probit 방법은 SPSS for Windows (Release 14.0K, SPSS Inc., USA)를 이용하여 평가하였으며, p-value가 0.05 이하인 경우 통계적 유의성을 인정하였다.
결 과
- 1. 사망률
우황청심원 투여와 관련 있는 사망례는 실험 전 기간동안 관찰되지 않았다.
- 2. 임상증상
실험동물의 행동, 자극에 대한 반응성, 각성도 및 경계성, 자세 및 보행 이상 등에서 우황청심원 투여와 관련된 특이한 임상증상은 실험 전 기간 동안 관찰되지 않았다.
- 3. 체중 변화
본 실험의 결과, 암컷 1,000 및 500 ㎎/㎏ 투여군에서만 투여일 ~ 투여 후 7일 동안의 체중이 암컷 매체 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.05) 증가를 나타내었으며, 우황청심원 투여와 관련된 체중 변화는 나타나지 않았다( Table 3 ).
Body Weight Gains in Female and Male Mice after Single-dose Oral Administration of WHCSW
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Values are expressed as mean ± SD g of five mice. WHCSW, Woohwangchungshim-won. a Day of administration after overnight fast. b Day of sacrifice after overnight fast. * p<0.05 as compared with female vehicle control by MW test.
- 4. 장기 중량 변화
각각의 동일 성별 매체 대조군에 비해 의미 있는 장기 중량 변화는 모든 우황청심원 투여군에서 관찰되지 않았다( Table 4 - 7 ).
Changes on the Absolute Organ Weights Observed in Male Mice after Single-dose Oral Administration of WHCSW
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Values are expressed as mean ± SD of five mice, g.WHCSW, Woohwangchungshim-won L, left sides; S, splenic lobes a Submandibular lymph node
Changes on the Absolute Organ Weights Observed in Female Mice after Single-dose Oral Administration of WHCSW
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Values are expressed as mean ± SD of five mice, g. WHCSW, Woohwangchungshim-won L, left sides; S, splenic lobes a Submandibular lymph node
Changes on the Relative Organ Weights Observed in Male Mice after Single-dose Oral Administration of WHCSW
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Values are expressed as mean ± SD of five mice, % of body weight.WHCSW, Woohwangchungshim-won L, left sides; S, splenic lobes a Submandibular lymph node
Changes on the Relative Organ Weights Observed in Female Mice after Single-dose Oral Administration of WHCSW
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Values are expressed as mean ± SD of five mice, % of body weight. WHCSW, Woohwangchungshim-won L, left sides; S, splenic lobes a Submandibular lymph node
- 5. 부검소견
폐충혈은 암컷 500 ㎎/㎏ 투여군을 제외한 모든 실험군 및 암수 매체 대조군에서 관찰되었다. 흉선 위축은 암수 매체 대조군을 포함한 수컷 1,000 및 2,000 ㎎/㎏ 투여군에서 관찰되었다. 비장 위축은 암수 매체 대조군을 포함한 수컷 1,000 ㎎/㎏ 투여군, 암컷 500 및 1,000 ㎎/㎏ 투여군에서 관찰되었다. 악하임파절 종대는 수컷 매체 대조군 및 500 ㎎/㎏ 투여군, 암컷 500, 1,000 및 2,000 ㎎/㎏ 투여군에서 관찰되었으며, 자궁 부종 소견이 암컷 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에서 관찰되었다. 결론적으로 우황청심원 투여와 관련된, 또는 우황청심원에 대한 용량 의존적인 육안적 부검소견은 관찰되지 않았다( Table 8 & 9 ).
Necropsy Findings Observed in Male Mice after Single-dose Oral Administration of WHCSW
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Gross Findings at Sacrifice (Day 14) Observed animals/total observed animals of five mice WHCSW, Woohwangchungshim-won a Bilateral submandibular lymph node
Necropsy Findings Observed in Female Mice after Single-dose Oral Administration of WHCSW
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Gross Findings at Sacrifice (Day 14) Observed animals/total observed animals of five mice WHCSW, Woohwangchungshim-won a Bilateral submandibular lymph node
Histopathological Findings Observed in Male Mice after Single-dose Oral Administration of WHCSW
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Microscopical Findings at Sacrifice (Day 14) Observed animals/total observed animals of five mice WHCSW, Woohwangchungshim-won a Left submandibular lymph node Abbreviations: cDE, decreases of cortex lymphoid cells; rHP, hyperplasia of red pulp lymphoid cells; fFC, focal fatty changes; IF, focal inflammatory cell infiltration
Histopathological Findings Observed in Female Mice after Single-dose Oral Administration of WHCSW
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Microscopical Findings at Sacrifice (Day 14) Observed animals/total observed animals of five mice WHCSW, Woohwangchungshim-won a Left submandibular lymph node Abbreviations: cDE, decreases of cortex lymphoid cells; rHP, hyperplasia of red pulp lymphoid cells; wDE, decreases of white pulp lymphoid cells; IF, focal inflammatory cell infiltration; DM, desquamation of mucosa layers
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Histopathological changes detected in the lung after single-dose oral administration of WHCSW. Note that slight [1+] lung focal congestional spots – thickening of alveolar lung inflammatory cell infiltration with/without focal hemorrhages were randomly detected throughout the experimental groups tested regardless of genders including both genders of vehicle controls as sporadic finings not WHCSW administration related toxicological signs. WHCSW, Woohwangchungshim-won A, alveolar sac‐respiratory bronchiole; B, bronchiole All hematoxylin & eosin stain; Scale bars = 200 ㎛.
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Histopathological changes detected in the thymus. Note that slight [1+] or moderate [2+] decreases of lymphoid cells (DE; as seen vacuoles or loosening) in the thymic cortex were randomly detected throughout the experimental groups tested regardless of genders including both genders of vehicle controls as sporadic finings not WHCSW administration related toxicological signs. In addition, one mouse (1/5; 20 %) in female vehicle control showed slight congestion as sporadic findings. HCSW, Woohwangchungshim-won DE, decreases of lymphoid cells C, cortex; M, medulla All hematoxylin & eosin stain; Scale bars = 200 ㎛.
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Histopathological changes detected in the spleen. Note that slight [1+] hyperplasia of lymphoid cells and megakaryocytes in the red pulp (rHP) were randomly detected throughout the experimental groups tested regardless of genders including both genders of vehicle controls as sporadic finings not WHCSW administration related toxicological signs. In addition, one mouse (1/5; 20 %) in female vehicle control showed slight decreases of white pulp lymphoid cells (wDE; as seen vacuoles) as sporadic findings. HCSW, Woohwangchungshim-won rHP, hyperplasia of lymphoid cells and megakaryocytes in the red pulp wDE, decreases of white pulp lymphoid cells R, red pulps; W, white pulps; M, megakaryocytes All hematoxylin & eosin stain; Scale bars = 200 ㎛.
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Histopathological changes detected in the liver. Note that slight [1+] focal fatty changes (fFC) were restrictedly observed in one (1/5; 20 %) male vehicle control as sporadic finding. In addition, slight focal inflammatory cell infiltrations (IF) were also restrictly detected in one (1/5; 20 %) female and male mice administered WHCSW 500 ㎎/㎏ as sporadic finding not WHCSW administration related toxicological signs because of dose‐independent frequencies. WHCSW, Woohwangchungshim-won fFC, focal fatty changes IF, focal inflammatory cell infiltrations C, central veinAll hematoxylin & eosin stain; Scale bars = 200 ㎛.
- 6. 조직병리학적 소견
경미[1+]한 폐충혈(폐포 벽의 비후와 염증세포 및 적혈구 축적)이 암수 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에서 산발적으로 관찰되었다( Fig. 1 ). 경미[1+]하거나 중등도[2+]의 흉선 피질 임파구 감소가 암수 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에서 산발적으로 관찰되었고, 경미[1+]한 흉선 피질 임파구 충혈이 암컷 매체 대조군에서 1례 관찰되었다( Fig. 2 ). 경미[1+]한 비장 적색수질 임파구 과다증식 또는 백색수질 임파구 감소( Fig. 3 ), 경미[1+]한 간 국소 지방 변화( Fig. 4 ), 경미[1+]한 악하임파절 임파구 감소( Fig. 5 ) 및 경미[1+]하거나 중등도[2+]의 자궁 점막 탈락( Fig. 6 ) 소견이 암수 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에서 산발적으로 관찰되었다. 한편, 암수 500 ㎎/㎏ 투여군에서만, 경미한 간 국소염증세포 침윤 소견( Fig. 4 )이 각각 1례(1/5; 20 %) 관찰된 이외에 우황청심원 투여와 관련된 조직병리학적 소견은 나타나지 않았다( Table 10 , 11 ).
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Histopathological changes detected in the submandibular lymph node. Note that slight [1+] decreases of lymphoid cells (DE; as seen vacuoles) were restrictly detected one (1/5; 20 %) mouse in female vehicle control mice as sporadic finings. WHCSW, Woohwangchungshim-won DE, decreases of lymphoid cells All hematoxylin & eosin stain; Scale bars = 200 ㎛.
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Histopathological changes detected in the uterus. Note that slight [1+] or moderate [2+] desquamation of uterus mucosa (DM) were observed in one (1/5; 20 %) or two (2/5; 40 %) female mice in vehicle control, WHCSW 2,000 and 1,000 ㎎/㎏-administered group as a process of estrus cycle. WHCSW, Woohwangchungshim-won L, lumen; M, muscle layer All hematoxylin & eosin stain; Scale bars = 200 ㎛.
고 찰
우황청심원은 宋代(A.D. 1107년경) 太平惠民和劑局方에 최초로 기재된 처방으로 心胸熱毒을 치료하는 九味淸心元과 虛勞羸瘦, 脾胃虛弱, 飮食減少, 或大病後 氣不復常, 漸成勞損 등을 다스리는 大山芋丸을 合方한 것에서 熟地黃을 去한 處方이다 18) . 우리나라에서는 광해군 5년(A.D. 1613년)에 발간된 東醫寶鑑 2) 에서 처음 수록되었는데, 중풍으로 인한 人事不省, 痰涎壅盛, 言語蹇澁, 口眼喎斜, 手足不遂등의 증상에 사용한다고 하였다.
東醫寶鑑에 수록된 우황청심원의 약물내용은 牛黃, 山藥, 甘草, 人蔘, 蒲黃, 神麯, 麝香 등을 비롯한 총 28종의 한약재로 구성되어 있는데, 최근에는 東醫寶鑑에 수록된 처방 구성 약물 중 朱砂, 石雄黃, 犀角을 제외하고, 大棗, 蜂蜜등을 가하여 丸으로 만든 다음, 金箔을 입혀 丸劑로 많이 사용하고 있으며, 제약 회사를 중심으로 현탁액 제제로의 제형변화를 위한 노력이 이루어졌다 4 , 19) . 제약 회사에서는 麝香의 대체 물질인 l-muscone과 靈猫香이 함유된 새로운 우황청심원의 개발에 성공하여 시판하고 있어 국내에서의 우황청심원에 관한 관심과 연구는 한의학계 뿐만 아니라 제약업계에서도 활발하다 4) .
한의학계에서 진행된 대부분의 기존 연구들은 우황청심원의 효능을 입증하는 것에만 초점을 맞추고 있으며, 우황청심원의 부작용 및 인체에 미치는 독성에 대한 한의학계의 연구는 朱砂가 함유된 우황청심원을 장기투여하였을 경우 인체의 혈중 수은 농도와 혈구 및 간, 신기능에 미치는 영향에 대한 임상 연구가 진행된 것이 유일하다. 이 연구의 결과에 따르면 우황청심원의 상용량(1일 1환)을 투여하는 경우에는 수은 중독 및 혈구의 변화, 간, 신기능의 변화는 일으키지 않는 것으로 보고되고 있다 4 , 20) .
본 연구에서는 우황청심원의 일반 독성시험 중 현재 한국식품의약품안전청 고시 “의약품 등의 독성시험기준” 14) 에 명시되어 있는 마우스 경구 단회투여독성 시험을 실시하여, 장기투여 독성시험과 생식 · 발생독성 시험을 위시한 특수 독성시험에 대한 기초자료를 제공 및 우황청심원에 대한 유효성 평가, 임상적 유효용량 설정 및 적정 투여용량, 최대 용량 설정을 위한 연구에 근거를 제공하고자 하였다.
본 실험에서는 이전의 우황청심원 환제 및 액제에 대한 마우스에서의 7일간 예비 독성 실험 12) 및 간 독성에 대한 랫트에서의 급성 및 아급성 독성 실험 13) 에서, 뚜렷한 독성 증상이 나타나지 않았기 때문에, 한국식품의약품안전청 고시 제 2009-116호 14) 와 OECD 실험기준 #423 15) 에 의거하여, 설치류 최고 한계투여용량인 2,000 ㎎/㎏을 최고 용량으로 설정하였으며, 공비 2로 1,000 및 500 ㎎/㎏을 중간 및 저용량으로 설정하였다. 이후 마우스를 대상으로 단회 경구투여하고, 14일간 체중 및 임상증상을 관찰하였으며, 14일 후 최종 부검을 통하여 12개의 주요 장기에 대한 장기 중량, 육안 부검 및 조직병리학적 관찰을 실시하였다.
그 결과, 단회투여 독성 시험에서 설치류 최대 한계투여 용량인 2,000 ㎎/㎏까지 우황청심원 투여와 관련된 사망례가 관찰되지 않았으며, 우황청심원 투여와 관련된 임상증상, 체중, 체중증가량 및 장기 중량 변화 역시 관찰되지 않았다. 또한 육안부검시 다양한 정도의 폐충혈, 흉선 위축, 비장 위축, 악하임파절 종대 및 자궁 부종 소견이 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에서 산발적으로 관찰되었다, 한편 조직병리학적 검사시 경미하거나, 중등도의 폐충혈, 흉선 피질 임파구 감소 또는 충혈, 비장 적색수질 임파구 과다증식 또는 백색수질 임파구 감소, 간 국소 지방 변화, 악하임파절 임파구 감소 및 자궁 점막 탈락 소견이 암수 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에서 산발적으로 관찰되었다. 단지, 암수 500 ㎎/㎏ 투여군에서만 간에 경미한 국소 염증세포 침윤 소견이 각각 1례(1/5; 20 %) 나타난 이외에 우황청심원 투여와 관련된 육안 부검 및 조직병리학적 소견은 관찰되지 않았다.
본 실험에 사용한 실험동물의 체중 및 장기중량은 동일한 주령의 마우스들의 정상 범주21,22) 내에서 관찰되었으며, 암컷 1,000 및 500 ㎎/㎏ 투여군에서만 투여일∼투여 후 7일 동안의 체중이 유의성 있게(p<0.05) 증가했으나, 용량 의존적 변화는 없어 우황청심원 투여와 관련 있는 독성으로 추정하기는 어렵다.
한국식품의약품 안전청 고시 제 2009-116호 14) 및 OECD 기준 #423 15) 에 따르면, 설치류에서 투여한계 농도를 2,000 ㎎/㎏ 또는 최대 용해농도로 규정하고 있고, 투여 용량은 20 ㎖/㎏을 넘지 못하게 규정하고 있다. 본 실험에서 사용한 우황청심원 미세분말은 멸균 증류수에 100 ㎎/㎖까지 비교적 잘 현탁되어, 20 ㎖/㎏의 용량 즉, 2,000 ㎎/㎏을 최고 농도로 투여하였다.
앞에서 살펴본 육안 부검시 나타난 다양한 소견들과 조직병리학적 검사에서 나타난 소견들은 암수 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에서 산발적으로 관찰되었으며, 용량 의존성은 없어, 우황청심원 투여와 관련 없는 우발적 병소로 판단되고, 이들 병소들은 정상 마우스에서도 나타날 수 있는 소견으로 알려져 있다 23 , 24) . 특히 자궁은 estrus cycle에 따라 쉽게 변화할 수 있어 25 , 26) , 자궁 부종은 estrus cycle에 따른 이차적 변화로 판단된다. 또한 암수 500 ㎎/㎏ 투여군에 국한된 경미한 간의 국소 염증세포 침윤 소견 역시 용량 의존성이 인정되지 않아, 우황청심원 투여와 관련된 독성증상은 아닌 것으로 판단되며, 이들은 역시 정상 마우스에서도 나타날 수 있는 소견이다 23 , 24) .
US Environmental Protection Agency OPPTS 870.100 27) 에 따르면 일반적으로 반수 치사량이 5,000 ~ 15,000 ㎎/㎏인 물질을 무독성 물질로, 500 ~ 5,000 ㎎/㎏을 비교적 저독성(Class III) 물질로 규정하고 있으나, 한국식품의약품 안전청 고시 제2009-116호 14) 및 OECD 기준 #423 15) 에 따르면, 설치류에서 투여한계 농도를 2,000 ㎎/㎏으로 제한하고 있다. 이상의 결과를 볼때, 본 실험의 마우스 단회 경구투여 독성실험에서 우황청심원의 반수치사량 및 개략적 치사량은 각각 2,000 ㎎/㎏ 이상으로 나타나 비교적 안전한 약물로 판단된다. 본 연구는 우황청심원에 대한 유효성 평가, 임상적 유효 용량 설정 및 적정 투여 용량, 최대용량 설정을 위한 근거로 사용될 수 있을 것으로 생각되며, 향후 이에 대한 연구가 지속적으로 이루어져야 할 것으로 보인다.
결 론
우황청심원의 마우스 단회 경구투여 독성평가 실험을 수행한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다.
우황청심원 2,000 ㎎/㎏까지 투여와 관련된 사망례는 관찰되지 않았다. 일부 용량 비의존적으로 나타난 우발적 병소와 체중증가를 제외하고, 우황청심원 투여와 관련된 임상증상, 체중, 체중증가량, 육암부검 및 장기 중량 변화 역시 관찰되지 않았다.
12개 장기에 대한 조직병리학적 검사에서도 우황청심원 투여와 관련된 이상 변화는 관찰되지 않았다.
이와 같은 결과를 통하여 볼 때, 우황청심원의 반수치사량(LD50) 및 개략적 치사량(ALD)은 각각 2,000 ㎎/㎏이상으로 관찰되어, 비교적 안전한 약물로 판단된다.
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