Advanced
Antioxidant Ability and Hair Growth Effect of Samhwang-Sasimtang in C57BL/6 Model
Antioxidant Ability and Hair Growth Effect of Samhwang-Sasimtang in C57BL/6 Model
Journal of Physiology & Pathology in Korean Medicine. 2014. Apr, 28(2): 154-161
Copyright © 2014, The Korean Association of Oriental Medical Physiology
  • Received : February 23, 2014
  • Accepted : March 31, 2014
  • Published : April 25, 2014
Download
PDF
e-PUB
PubReader
PPT
Export by style
Article
Author
Metrics
Cited by
TagCloud
About the Authors
민지 김
교현 박
인철 이
배환 김
kim9399@kmu.ac.kr

Abstract
The purpose of this study is to evaluate the antioxidant activity and hair growth effects of a natural herbal ethanol extract, Samhwang-Sasimtang(SS). In case of antioxidant ability of SS, the content of phenolic compounds was 28.44mg/g. The extract showed strong electron donating ability and free radical scavenging activity in a concentration-dependent manner. SOD-like activity also rose through increasing the concentrations of SS. In order to estimate the hair growth effects, the extract was applied to the back of seven-week-old C57BL/6 male mice (150㎕ a day, five days a week, for four weeks) in four groups (C, control, saline; PC, positive control, 3% minoxidil; E1, experimental 1, 1% SS; E2, experimental 2, 2% SS). Ten mice were assigned to each group and five mice in each group were sacrificed at weeks 2 and 4, respectively. There was no a significant difference in body weight change among experimental groups. In macroscopic observation of hair growth at week 4, the scores of hair growth on the backs of mice were 80, 60, 40 and 20% in the PC, E2, E1 and C groups. In terms of histological observation, the ratio and thickness of hair follicles, the enzyme activities of ALP and γ-GT, immunohistological examination of IGF-1 and VEGF which are the hair growth factors, in each group were significantly high in this order: PC, E2, E1 and C group, at week 4. Meanwhile, hair growth inhibition factors, TGF-β1 and Caspase-3, were reduced in PC, E1 and E2 groups compared with C group. These results indicate that SS extract may be effective in promoting hair growth, and suggest that it can be used practically as a superior natural agent for hair growth promotion.
Keywords
서 론
현대사회에서 모발은 머리보호 및 머리의 온도 유지 등 인체에서 중요한 기능을 하고 있지만, 무엇보다도 외모를 결정짓는 신체의 중요한 일부분으로서의 의미가 점점 강해지고 있다 1) . 이런 이유로 탈모에 대한 연구는 최근 그 관심도가 날로 높아지고 있다고 할 수 있다. 전 세계적으로 탈모인구는 지속적으로 증가하고 있으며, 모발 관리 대상자의 연령층도 20∼30대로 점점 젊어지고 있고, 여성에서의 탈모 인구 비중 또한 급증하고 있는 추세이다 2) . 국내의 경우 성인 남성의 23%인 350만 명 정도가 탈모증세를 보이고 있고, 여성과 청소년을 포함하여 탈모증을 호소하는 환자의 숫자는 천만 명을 넘을 것으로 추정되고 있어 이에 따른 사회경제적 문제도 심각하다 3) . 탈모증 환자들은 외모의 변화에 따른 심리적 우울증, 수치심 증가, 사회적 소외 및 분노 표출 등의 높은 스트레스 지수로 인해 고통 받고 있으며, 또한 대인 및 이성 관계 위축 등의 어려움도 겪고 있기 때문에, 탈모증상은 사회적, 정신적 고통을 넘어 보건학적인 문제로 대두된다고 볼 수 있다 4) .
탈모의 원인은 유전적 요인과 스트레스 및 노화 등이 있는데, 그 대표적인 기전은 남성호르몬인 testosterone(T)이 5α-reductase(RD)에 의하여 dihydrotestosterone(DHT)으로 전환되어 두피의 모낭을 위축시켜 탈모를 유발하는 것이다. 나이가 들면 DHT가 증가되어 모낭세포의 단백질 합성이 지연되고 이로 인해 휴지기 모낭의 비율이 증가되면서 탈모의 진행이 빠르게 진행된다고 볼 수 있다 5) .
탈모는 각 성장주기에 작용하는 다양한 인자들의 변화에 의해 진행된다. 이들 인자 중 모발성장을 촉진하는 생화학적 효소인 γ-glutamy1 transpeptidase(γ-GT)는 증식과 분열이 활발한 세포내에서 많이 발현되며, 또 하나의 모발 성장인자로서 중요하게 고려될 수 있는 alkaline phosphatase(ALP)는 모발생성과정 중모기질(hair matrix)내 새로운 혈관 생성에 관여하여 모발성장을 촉진하는 것으로 알려져 있어, 이들 인자는 모발성장 촉진시 활성이 증가되기 때문에 모발성장의 지표로 활용될 수 있는 효소들이다 6) .
모발주기는 모발의 성장이 촉진되는 성장기(anagen), 성장을 멈추고 모구부가 축소되면서 대사과정이 늦어지는 퇴행기(catagen), 모낭이 수축되면서 위쪽으로 올라가는 휴지기(telogen)로 구분된다. 모발의 각 성장주기에 있어서 다양한 인자들이 작용하여 양모 또는 탈모를 유발하게 된다. 아직까지 모발 성장주기를 조절하는 기전은 명확하게 밝혀져 있지는 않지만, 다양한 성장인자와 protein kinase C, 줄기세포 인자(stem cell factor), cytokine 등의 요인들이 중요하게 작용하는 것으로 알려져 왔다 7) . 즉 다양한 신호 전달 인자(signal transduction factor)가 모발의 성장주기에 따라 적절히 작용함으로써 발모 또는 탈모를 유발시킨다 8) . IL-1과 TNF 등은 피부에 존재하는 cytokines으로 모발세포의 세포사를 유발하여 탈모를 일으키며, transforming growth factor beta 1(TGF-β1)은 모발의 성장기 시기에서 모발성장을 방해하고, 남성호르몬인 안드로젠(androgen)은 모발의 성장기를 단축시켜 정상보다 빨리 퇴행기로 접어들게 한다 9) . 반면에 Bcl-2는 anti-apoptosis 인자로 알려져 있으며, 기존 연구에 의하면 Bcl-2 결핍 마우스에서 모발성장기가 지연된다고 알려져 있고, Bcl-2의 발현은 모발 성장 주기에서 성장기의 발육능력을 촉진시키고, 모낭의 퇴화를 억제시킨다고 보고되어 있다 10) .
일반적으로 모발성장인자로는 insulin like growth factor 1(IGF-1), vascular endothelial growth factor(VEGF)가 알려져 있고 모발억제인자로는 TGF-β1과 Caspase-3가 알려져 있으며, 이들 지표는 항체를 이용한 면역 조직 염색을 통해 쉽게 그 발현양상을 평가해 볼 수 있다.
지금까지 모발 성장촉진에 효과가 있는 약물로는 미국 식약청(Food and Drug Administration, FDA)에서 공식적으로 허가를 받은 미녹시딜(minoxidil)과 피나스테라이드(finasteride)가 있다. 미녹시딜은 미국 Pharmacia & Upjohn사에서 개발한 고혈압 치료제로 Rogaine이란 상품명으로 승인 받았으나 육모효과가 인정되면서 바르는 발모제로 개발되었다. 그러나 피부에 가려움증, 홍반, 표피 벗겨짐과 건성화를 동반한 염증, 알레르기성 접촉성 피부염 및 지루성 피부염 등의 부작용이 보고되면서 사용상 주의를 필요로 하고 있다. 한편 피나스테라이드는 Propecia라는 상품명으로 제약회사인 Merck에서 개발한 5α-reductase 억제제로서, 처음에는 전립선 치료제로 개발되었다가 부작용으로 발모작용이 나타나 먹는 발모제로 전환되어 사용되고 있다. 발모작용 기전은 명확하지는 않지만 영양공급을 증가시키기 위해 혈관을 확장하거나 칼륨 통로를 여는 등의 효과가 모발성장을 유도하는 것이라 알려지고 있다. 이러한 약물은 육모 효능은 우수하지만 모발성장 효과 유지를 위해 평생 동안 지속적으로 사용해야 하는 단점이 있고, 또한 일부 약물은 남성의 성기능 억제와 가임여성의 기형아 출산과 같은 부작용이 수반될 수 있기 때문에 안전성 측면에서 문제점을 야기할 수 있다 11) . 그러므로 최근에는 전 세계적으로 모발성장 효능은 우수하면서 안전성이 좋은 천연 추출물에 대한 관심이 높아지고 있으며, 이를 이용하여 세포학적, 조직학적, 생화학적 또는 분자생물학적 연구를 통한 모발성장 효능 연구가 활발히 진행되고 있다.
금궤요략에 처음 기재된 처방인 삼황사심탕은 고혈압, 고지혈증, 동맥경화증, 불면증, 구내염 등의 치료에 많이 활용되는 처방중 대표적인 것으로, 항산화, 항균에도 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 삼황사심탕은 사심탕이라고도 하며 심기부족, 토혈 및 육혈에도 많이 사용된다 12) . 삼황사심탕은 대황, 황련, 황금으로 된 생약복합제제의 처방이며 청열사화, 해독, 청열화습, 사하, 지혈 등의 효능이 있어, 심화상염으로 인한 실열을 치료하는 기본 처방이기도 하다 13) . 대황의 경우 약효연구에서 실험동물에 대한 총 콜레스테롤의 상승을 억제하는 효과를 보이는 것으로 알려져 있고, 황금과 황련의 약효 연구에서는 동맥경화의 예방효과가 있다고 보고되어져 있으며, 황금의 플라보노이드 성분에 대한 연구에서 실험적 고지혈증, 지방간 형성 및 간 콜레스테롤 및 중성지방 수치의 저하작용이 보고되어져 있다 14) . 삼황사심탕약침을 이용한 혈행개선 및 항산화효과 연구에 있어서, 고지혈증 및 비만 개선과 항산화능에 긍정적인 효능을 보여주고 있는데, 이는 이 처방이 생체 내 지질대사에 영향을 주어 순환계 질환에 긍정적인 효과를 가져다 줄 수 있음을 시사해 준다 15) . 아직까지 삼황사심탕을 이용한 육모효능 평가 연구는 없는 실정이며, 이상의 선행연구와 근본적인 효능인 열을 내리는 기능 등으로 짐작해 볼 때 삼황사심탕은 충분히 육모에 효과를 보일 것으로 보여진다.
이에 본 연구에서는 고혈압과 고지혈증, 동맥경화증 등에 효과가 있다고 보고된 삼황사심탕을 이용하여 항산화능을 평가하고, C57BL/6 마우스를 이용한 육모 모델에서 육안적 및 조직학적 관찰, 효소활성도 측정 및 조직면역학적 분석을 통해 모발 성장 촉진 기능성 소재로서의 적용 가능성을 평가하였다.
재료 및 방법
- 1. 시약 및 시료제작
항산화 평가의 대조군으로 카테킨(Sigma, USA)과 ascorbic acid (Sigma, USA)를 사용하였으며, in vivo 육모평가의 양성대조군으로는 3% 미녹시딜(현대약품)을 구입하여 사용하였다. 분석에 사용한 시약 중 ALP 및 γ-GT는 Thermo사(Finland)의 제품을, IGF-1, VEGF, TGF-β1, Caspase-3의 immunohistochemical markers는 Abcam사(Cambridge, UK)의 제품을 사용하였으며, 그 외 일반 시약들은 특급품을 사용하였다.
실험물질로 사용한 삼황사심탕은 경북 영천 소재의 (주)옴니허브에서 구입하여, 물로 세척하고 응달에서 건조 후 대황(42.8 g), 황련(28.6 g), 황금(28.6 g)을 구성비로 섞은 후, 시료 중량대비 10배의 70% 에탄올 가하여 실온에서 24시간 동안 교반 추출하고, 상등액과 침전물을 분리하는 방법을 3회 반복하여 추출하였다. 각 추출물을 여과 농축하여 동결건조 후 올리브 오일에 녹여 각 시험에 사용하였다.
- 2. In vitro 항산화능 실험
- 1) 총 페놀 함량 측정
추출한 시료 5.2 ㎎에 증류수 1 ㎖를 첨가한 후, 이 중 0.5 ㎖를 시험관에 넣고 phenol reagent 1.5 ㎖를 가하여 골고루 섞어주고 5분간 방치하였다. Na 2 CO 3 포화용액 0.5 ㎖ 첨가하여 1시간 가한 다음 1N HCl(0.1 ㎖)을 넣고 640 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량은 tannic acid(Sigma, USA)를 이용한 표준곡선으로 양을 환산하였다 16) .
- 2) DPPH의 전자공여능 측정
메탄올에 녹인 각 시료용액 2 ㎖에 0.2 mM의 DPPH 1 ㎖를 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료용액의 첨가군와 대조군의 흡광도 감소율로 나타내었다 17) .
PPT Slide
Lager Image
- 3) Free radical 소거능 측정
Free radical 소거능은 ABTS+ cation decolorization assay에 의하여 시행하였다 18) . 7 mM 2,2-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)와 2.45 mM potassium persulfate를 최종 농도로 혼합하여 실온인 암소에서 12시간 동안 방치하여 ABTS+을 형성시킨 후 734 nm 파장에서 흡광도 값이 0.7(±0.02)이 되게 ethanol로 희석하였다. 농도별로 희석된 sample 100 ㎕에 희석된 ABTS용액 100 ㎕용액 가하여 암실에서 7분 동안 방치한 후 734 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각 추출물의 라디칼 소거활성은 추출물을 첨가하지 않은 대조군의 흡광도 값을 보정하여 나타내었다.
- 4) Superoxide dismutase(SOD) 유사활성 측정
DMSO에 녹인 각 시료용액 0.2㎖에 tris-HCl 완충용액(50mM tris+10mM EDTA, pH 8.5) 2.6 ㎖를 첨가하여 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1N HCl 0.1 ㎖를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양을 420 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 시료용액의 첨가군과 대조군의 흡광도 감소율로 나타내었다 19) .
PPT Slide
Lager Image
- 3. In vivo 육모효과 실험
- 1) 실험동물 처치
6주령 수컷 C57BL/6 마우스를 (주)샘타코(Osan, Korea)로부터 분양받아 사육실에서 1주간 적응 시킨 후, 등 부위를 동물용 전기제모기(electric clipper)로 제모하고 군당 10마리씩 4개 군으로 군 분리하여 시료를 1일 1회 150 ㎕씩 주 5회 4주간 경피 도포하였다. 실험군은 용매로 올리브 오일을 도포한 대조군(C), 3% 미녹시딜을 도포한 양성대조군(PC), 1% 삼황사심탕을 도포한 실험군1(E1) 및 2% 삼황사심탕을 도포한 실험군2(E2) 군으로 나누어 실험을 실시하였다. 실험동물은 온도 22 ± 3℃, 습도 50 ± 10%, 명암주기 12시간 밤과 낮 단위로 조절되는 표준사육 환경에서 사육하였고 실험기간 동안 사료(Purina, 한국)와 물의 양은 제한 없이 공급하였다. 실험의 모든 과정은 계명대학교 동물실험 윤리위원회의 허가(승인번호 KM-2011-62)를 얻은 후 가이드라인에 의거하여 실험을 진행하였다.
실험동물은 2, 4주차에 군당 각 5마리씩 부검하였으며, 12시간 절식 후 에테르(ether) 마취하에 피부조직을 절취하여 조직학적 변화를 보기 위해 10% 포르말린 용액에 고정하였다. 음수량, 사료량 및 체중은 매주 1회 오전10시에 측정하였으며, 이를 바탕으로 사료효율을 계산하였다.
- 2) 처치 부위의 관찰
제모한 등 부위의 발모상태를 보기 위해 실험 1, 2, 3, 4주차에 주 1회 에테르 마취 후 사진 촬영하였다. 각 군의 모발성장 효과는 각각의 동물을 육안으로 관찰하여 발모 정도에 따라 0-19%(-), 20-39%(±), 40-59%(+), 60-79%(++), 80-100%(+++)로 판정하였으며, 각 군별로 평균치를 산정하였다. 또한 실험 2, 4주차에 마리당 10개씩 등 부위의 털을 뽑아 털 길이의 평균을 산정하였으며, 4주차에 모든 털을 제거하여 털 무게를 측정하였다.
- 3) 조직학적 관찰
실험 2, 4주차에 절취 고정한 피부조직을 hematoxylin and eosin(H&E) 염색한 후 100배율 광학현미경으로 모낭 수를 계수하고, 진피의 두께와 모낭 깊이의 변화는 현미경 프로그램의 scale bar를 이용하여 측정하였다.
- 4) 피부조직의 효소활성도 측정
실험 2, 4주차에 피부조직을 절취하여 빙냉하에서 미세절편으로 만들고, 그 중 일정량을 칭량한 후, 피부조직의 4배량의 인산완충용액(phosphate buffer solution, PBS)을 가하여 마쇄기(homogenizer)를 이용하여 균질액을 만들었다. 이 균질액을 원심분리기를 이용하여 4℃에서 12,000rpm으로 20분간 원심 분리하여 그 상층액을 자동생화학 분석기(Konelab 20XT, Thermo, Finland)를 이용하여 Alkaline phosphatase(ALP) 및 γ-Glutamyl transpeptidase(γ-GT)를 분석하였다.
- 5) 피부조직의 면역조직학적 관찰
실험 2, 4주차에 절취, 고정한 피부조직을 두께 3㎛ 파라핀 절편을 만들어 전자동 면역 염색기(Benchmark XT, Roche-Ventana, USA)를 이용하여 기기의 manual에 맞춰 조직을 면역염색 하였다. 측정을 위해 Ventana Ultraview DAB Kit를 사용하였다. 면역 조직 염색에 사용된 항체는 성장인자로는 IGF-1, VEGF를 사용하였고, 억제인자로는 TGF-β1, Caspase-3을 사용하였다.
- 4. 통계처리
SPSS 18.0 for windows(SPSS Inc., USA) 통계프로그램을 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였다. 각 그룹 간의 차이를 검정하기 위하여 Duncan's multiple range test를 이용하여 사후분석을 실시하였다. 본 연구의 통계학적인 유의성 검증은 p<0.05로 하였다.
결 과
- 1. In vitro 항산화능 실험
- 1) 총 페놀 함량
총 페놀 함량 결과는 3번 반복(29.12, 28.25, 27.96)하여 평균 값을 측정하였으며 삼황사심탕의 총 페놀 함량은 28.44±0.60 mg/g이었다.
- 2) DPPH의 전자공여능, Free radical 소거능 및 SOD 유사활성
삼황사심탕의 DPPH로부터의 전자소거능은 농도에 따라 용량 상관적인 증가를 나타내었으며, 1,000ppm에서 삼황사심탕이 99%의 높은 전자소거능을 나타내어 강력한 항산화제인 카테킨의 활성과 유사한 결과를 나타내었다. Free radical 소거능에 있어서는 농도에 따라 용량 상관적인 증가를 나타내었으며, 1,000ppm에서 삼황사심탕이 99.4%의 높은 free radical 소거능을 나타내어 강력한 항산화제인 카테킨의 활성과 유사한 결과를 나타내었다. SOD 유사활성의 경우에는, 삼황사심탕과 Vitamin C(ascorbic acid) 모두 농도에 따라 용량 상관적인 증가를 나타내었으며, 1,000ppm에서 삼황사심탕이 34%의 높은 활성을 나타내었다( Fig. 1 ).
PPT Slide
Lager Image
The electron-donating effects, ABTS radical scavenging activity and SOD-like activity of Samhwang-Sasimtang extract. Values are mean±SD of 5 replicates. SS: Samhwang-Sasimtang
- 2. In vivo 육모효과 실험
- 1) 음수량, 사료량, 체중 변동 및 사료효율 측정
사료효율은 양성 대조군군 실험군1에서 유의한 증가가 관찰되었다( Table 1 ). 체중은 실험기간 동안 양성대조군이 다른 군에 비해 증가를 보였으나 통계적 유의성은 인정되지 않았다(p>0.05).
Changes of Water and Feed Intake, Body Weight Gain and Feed Efficiency Ratio
PPT Slide
Lager Image
Values are mean±SD of 5 mice. Test compounds were topically applied to the backs of C57BL/6 mice for 4 weeks. C: Olive oil, PC: 3% Minoxidil, E1: 1% Samhwang-Sasimtang, E2: 2% Samhwang-Sasimtang 1)Feed efficiency ratio (%) = (Body weight gain / Feed intake) × 100. Values with different superscripts (a,b) in the same row are significantly different (p<0.05) by ANOVA and Duncan's multiple range tests.
- 2) 육안적 변화
제모한 등 부위 발모상태를 육안으로 관찰한 결과, 실험 1주차에는 모발이 자라지 않았으나 실험 2주차부터 양성대조군과 실험군2, 실험군1, 대조군 순으로 등 부위에서 털이 조금씩 자라는 것이 관찰되었다. 특히 양성대조군과 실험군1, 실험군2에서는 털이 자라는 모습이 뚜렷하게 관찰되었다. 실험 3주차에는 모든군의 마우스 등 부위에서 털이 자라는 것을 관찰할 수 있었으며 양성대조군과 실험군1은 40%이상의 모발성장을 보이기 시작하였다. 실험 4주차에는 양성대조군 90%, 실험군2에서 52%의 모발성장을 보였으며 실험군1에서도 38%의 모발성장이 나타났다. 반면 대조군은 다른 군에 비해 미미한 모발성장(20%)을 보였다(p<0.05)( Fig. 2 ).
PPT Slide
Lager Image
Photographs and scores of hair growth in C57BL/6 mice model applied with test compounds topically for 4 weeks. C: Olive oil group, PC: 3% Minoxidil group, E1: 1% samhwang-Sasimtang group, E2: 2% Samhwang-Sasimtang group. *Hair growth scoring index: 0-19%(-), 20-39%(±), 40-59%(+), 60-79%(++), 80-100%(+++)
- 3) 털 길이 및 털 무게
제모한 등 부위 발모상태에서 털을 뽑아 털 길이와 털 무게를 관찰한 결과, 실험 2주차에서의 털 길이는 실험군2, 실험군1, 양성대조군, 대조군순으로 등 부위 털이 긴 것으로 관찰되었으나 유의성은 나타나지 않았다. 실험 4주차에서의 털 길이에 있어 대조군에 비해 시험물질 처치군에서 유의성이 관찰되었고 실험군1, 양성대조군, 실험군2, 대조군 순으로 등 부위 털이 긴 것으로 관찰되었다. 털 무게에 있어서는 실험 2주차에서는 털이 많이 길지 않아서 무게가 측정되지 않았고, 실험 4주차에서는 대조군에 비해 시험물질 처치군에서 유의성은 없었지만 증가되는 양상이 관찰되었고 양성대조군은 유의한 증가가 관찰되었다(p<0.05)( Table 2 ).
Comparison in the Hair Length at Week 2 and 4, and Hair Weight at Week 4 in Mice
PPT Slide
Lager Image
Values are mean±SD of 5 mice. C: Olive oil, PC: 3% Minoxidil, E1: 1% Samhwang-Sasimtang, E2: 2% Samhwang-Sasimtang Values with different superscripts (a,b) in the same row are significantly different (p<0.05) by ANOVA and Duncan's multiple range tests.
- 4) 조직학적 변화
절취한 등 부위 피부조직을 H&E로 염색하여 광학현미경으로 관찰한 결과, 100배율에서 육안적으로 확인된 모낭의 수는 2주차에서 양성대조군이 대조군에 비해 189% 유의하게 증가하였고, 실험군1과 실험군2는 각각 48%, 56% 유의하게 증가하였다. 4주차에서는 양성대조군이 대조군에 비해 91% 유의하게 증가하였고, 실험군1과 실험군2에서는 각각 36%, 51% 유의하게 증가하였다(p<0.05).
모낭깊이(㎛)에 있어서 100배율에서 scale bar를 이용하여 측정한 결과 2주차에서 양성대조군이 대조군에 비해 120% 유의하게 증가하였으며, 실험군1과 실험군2는 각각 112%, 112% 유의하게 증가하였다. 4주차에서는 양성대조군이 대조군에 비해 114% 유의하게 증가하였고 실험군1과 실험군2에서는 각각 대조군에 비해 62%, 104% 유의하게 증가하였다(p<0.05).
진피 피부두께(㎛)를 100배율에서 scale bar를 이용하여 측정한 결과 2주차에서 양성대조군이 대조군과 유사하였으며, 실험군1과 실험군2는 각각 대조군에 대해 88%, 101% 수준이었다. 그리고 4주차에서 대조군에 비해 양성대조군이 98%였고, 실험군1과 실험군2에서는 98%, 110% 수준이었다. 진피두께에서는 실험군간 유의적 차이가 발견되지 않았다.
대조군에 비해 양성대조군> 실험군2> 실험군1 순으로 모낭의 수와 진피두께, 모낭깊이가 더 많이 성장된 것을 관찰할 수 있었고 4주차에서 모낭수가 가장 많아지고 진피두께, 모낭깊이도 가장 많이 두꺼워짐을 알 수 있었다( Fig. 3 4 ).
PPT Slide
Lager Image
Histological changes of hair follicle number, dermal thickness and hair follicle depth in C57BL/6 mice applied with test compounds topically for 4 weeks. C: Olive oil, PC: 3% Minoxidil, E1: 1% Samhwang-Sasimtang, E2: 2% Samhwang-Sasimtang, Hematoxylin and eosin staining, ×100.
PPT Slide
Lager Image
Changes of Hair Follicle Number, Depth and Dermal Thickness in the Skin of Mice. Values are mean±SD of 5 mice. Test compounds were topically applied to the backs of C57BL/6 mice for 4 weeks. The hair follicle number was determined by the average of three different fields with an eyepiece of ×100 magnification. C: Olive oil, PC: 3% Minoxidil, E1: 1% Samhwang-Sasimtang, E2: 2% Samhwang-Sasimtang Values with different superscripts (a,b,c) in the same week are significantly different (p<0.05) by ANOVA and Duncan's multiple range tests.
- 5) 피부조직의 효소활성도 변동
피부조직 내 ALP의 효소 활성도를 측정한 결과, 2주차에서 대조군에 비해 양성대조군이 가장 높은 활성을 나타내었고, 실험군1, 실험군2는 유의성을 나타내지 않았다. 4주차에서는 양성대조군이 대조군에 비해 64%, 실험군1과 실험군2는 각각 32%, 39%로 통계적으로 유의하게 높았다(p<0.05). ALP 활성은 주차별로 증가하는 경향을 보였으며, 2주차, 4주차 모두 양성대조군> 실험군2> 실험군1> 대조군 순으로 높은 활성을 보였다.
피부조직 내 γ-GT 활성을 주차별로 측정한 결과, 2주차에서 양성대조군은 대조군에 비해 약 37% 유의하게 높은 활성을 나타낸 반면 실험군1과 실험군2에서는 유의성이 없었다. 4주차에서는 양성대조군이 대조군에 비해 61%, 실험군1과 실험군2는 각각 28%, 37% 유의하게 높았다(p<0.05). γ-GT 활성은 주차별로 증가하는 경향을 보였으며, 4주차에 특히 양성대조군과 실험군1과 실험군2 모두 대조군에 비해 높은 활성을 보였다. 또한 2주차, 4주차 모두 양성대조군> 실험군2> 실험군1> 대조군 순으로 높은 활성을 보였다( Fig. 5 ).
PPT Slide
Lager Image
Changes of ALP and γ-GT activity in the skin of mice. Values are mean±SD of 5 mice. Test compounds were topically applied to the backs of C57BL/6 mice for 4 weeks. C: Olive oil, PC: 3% Minoxidil , E1: 1% Samhwang-Sasimtang , E2: 2% Samhwang-Sasimtang Values with different superscripts (a,b,c,d) in the same week are significantly different (p<0.05) by ANOVA and Duncan's multiple range tests.
- 6) 피부조직의 면역조직학적 변화
면역염색을 통해 관찰한 모발성장인자인 IGF-1과 VEGF의 염색정도를 점수화 하였을 때 양성대조군과 실험군2에서 높은 수치로 평가되었고, 양성대조군을 포함한 시험물질 처치군에서 짙고 뚜렷한 양성반점이 다수 관찰되었고 대조군에서는 거의 관찰되지 않았다. 모발성장억제인자인 TGF-β1과 Caspase-3의 염색정도를 점수화 하였을 때 대조군에 비해 양성대조군 및 실험군에서 수치가 낮아지는 경향으로 평가되었고, 대조군에서 다수 관찰된 짙고 뚜렷한 양성반점이 시험물질 처치군에서는 거의 관찰되지 않았다( Table 3 , Fig. 6 ).
Comparison of Grades in the Immunolocalization of Growth and Suppression Factors in the Back Skin of C57BL/6 Mice
PPT Slide
Lager Image
Values are mean±SD of 5 mice. C: Olive oil, PC: 3% Minoxidil, E1: 1% Samhwang-Sasimtang, E2: 2% Samhwang-Sasimtang Factor index: normal(-), minimally(±), slightly(+), moderate(++), severe(+++)
PPT Slide
Lager Image
Immunolocalization of growth factor in the back skin of C57BL/6 mice applied with test compounds topically for 4 weeks. C: Olive oil group, PC: 3% Minoxidil group, E1: 1% Samhwang-Sasimtang group, E2: 2% Samhwang-Sasimtang group. Immunohistochemical staining. x100.
고 찰
천연물질 중 항산화기능을 하는 것으로 널리 알려진 것은 역시 페놀성 물질이며, 각종 식물류에 폭넓게 분포되어 있다. 이 페놀성 물질은 다양한 구조를 가지며 phenolic hydroxyl group 부분이 항산화 등의 생리활성 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다 20) . 삼황사심탕의 폴리페놀함량은 28.44 mg/g으로 확인되었으며, 이는 삼황사심탕 내의 폴리페놀이 항산화 작용에 기여를 할 것임을 시사하고 있다.
DPPH방법은 활성 라디칼에 전자를 공여하여 지방질 산화와 인체 내 활성 라디칼에 의한 노화를 억제하는 척도로 이용될 수 있다. DPPH는 화학적으로 안정화 된 자유 라디칼을 가지고 있는 짙은 자색의 물질로 아스코르빈산, 토코페롤, 방향족 아민류 및 BHA 등의 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내어주고 라디칼이 소멸되어 색이 탈색되게 되므로 flavonoids 및 phenol성 물질 등이 많이 함유되어 있는 물질의 항산화작용 지표로 이용되고 있다. 또한 이 자유 라디칼은 인체 내에서 지질이나 단백질 등과 결합하여 노화를 쉽게 유발할 수도 있는데 페놀성 화합물은 자유 라디칼을 환원시켜 인체 내의 노화를 억제할 수 있는 척도로 활용될 수도 있다 21) . 삼황사심탕의 에탄올추출물은 DPPH 라디칼 소거능으로 관찰한 전자공여능 결과 농도 의존적 반응을 보여주어 항산화 작용 및 인체 노화 억제에도 좋은 물질로 작용할 것으로 기대된다. ABTS방법은 항산화제에 의해 감소되는 ABTS 양이온 라디칼의 흡광도를 측정하는 방법으로 potassium persulfate와 ABTS의 산화에 의해 라디칼을 형성시킨 후 각 시료의 자유 라디칼 소거능을 측정하여 항산화능을 확인할 수 있다 22) . 본 연구에서 삼황사심탕의 에탄올추출물은 250ppm까지 농도 의존적으로 증가하여 마찬가지로 좋은 자유 라디칼 소거능을 보였다. 항산화효소 SOD는 세포에 유해한 환원산소종을 과산화수소로 전환시키는 반응을 촉매 하는 효소이다 23) . 본 실험에서 삼황사심탕의 SOD 활성을 측정한 결과 250ppm까지 약간 증가되는 양상을 보이다가 그 이후 증가가 관찰되지 않아 SOD 유사활성은 높지 않은 것으로 사료된다. 산화적 스트레스와 활성 라디칼에 의해서 탈모가 촉진된다는 연구가 많이 있기 때문에 24) , 삼황사심탕의 항산화효과는 양모효능과 연관성이 높다고 할 수 있다.
C57BL/6 mouse는 사람과 유사한 검은색의 체모를 가져 모발성장의 성장주기를 색으로 쉽게 판정할 수 있다는 장점을 가지고 있기 때문에 모발연구에서 가장 널리 사용되고 있는 모델이다. 6주령부터 모발 주기가 휴지기로 들어가는 유전적인 특성이 잘 알려져 있기 때문에 이 시기에 실험을 시작하면 많은 장점이 있다. 또한 체모가 검은색이며 모낭에만 한정적으로 melanocytes가 존재하여 멜라닌 합성이 모발성장주기와 잘 일치한다 25) .
실험동물의 일반적인 임상적 이상증상을 확인하기 위하여 음수량, 사료량, 체중 및 사료효율 등을 측정하였는데, 삼황사심탕 처치로 인한 임상적 이상증상은 없는 것으로 생각되었다.
육안적인 육모현상 관찰을 위해 제모된 등피부에 4주간 시료를 도포한 결과, 실험 2주차에서 등부위쪽에 털이 조금씩 자라나기 시작하여 4주차에 양성대조군(80%), 실험군2(60%), 실험군1(40%)에서 대조군(20%)에 비해 높은 모발성장을 나타냈다. 털길이와 총 털 무게에 있어서도 시험물질 처치군에서 대조군에 비해 증가가 관찰되어, 삼황사심탕은 육안적인 관찰에서 육모를 촉진하고 있음을 보여주었다.
삼황사심탕이 모낭에 미치는 영향을 재확인하기 위해 피부조직을 H&E 염색한 후 모낭의 수, 모낭의 깊이 및 진피두께를 관찰하였다. 모발의 성장기는 멜라닌 합성이 시작되기 때문에 진피층이 두꺼워지고 모낭의 크기가 증가하고 진피와 피하지방으로 깊어지는 특징이 있다. 휴지기에서 성장기 II단계에는 모낭이 진피층에만 위치하고 피하지방까지는 도달하지 못하지만 성장기 III단계에서 모낭이 피하지방층까지 도달하게 되며 26) , 증가된 모낭의 길이는 퇴행기단계에서 다시 줄어들게 된다. 그러므로 성장기 모낭이 지속적으로 성장하고 퇴행기 모낭이 퇴화하는 것을 관찰해 보면 좋은 연관이 있기 때문에 진피와 피하조직의 길이 및 두께의 주기적 변화를 측정하는 것은 큰 의미가 있다.
광학현미경으로 관찰한 결과 모낭의 수에 있어 양성대조군은 대조군에 비해 유의한 증가를 보여주고 있으며, 실험군1과 실험군2는 2주차에 비해 4주차에서 증가되는 경향을 보여주고 있다. 모낭의 깊이에 있어서도 양성대조군을 포함한 모든 시험물질 처치군에서 대조군에 비해 유의적 증가를 보여주고 있다. 삼황사심탕은 휴지기 상태에서 성장기로 이동하는 모주기에서 성장기의 연장을 통해 모발성장에 효과가 있는 것으로 확인되었다.
주로 혈관 신생에 관여하는 ALP는 진피 유두에 밀집된 모세혈관에 영양을 공급하여 발모작용을 원활하게 해주는 지표로서 ALP 측정으로 발모작용을 간접적으로 추측할 수 있으며, non-growth 부위에 비해 re-growth 부위에서 ALP 활성이 현저히 증가함이 보고되고 있다 27) . 본 실험의 피부조직 내 ALP의 효소 활성도 측정 결과에서 실험군의 경우 2주차에 유의한 차이가 없었지만 4주차에서 용량상관적인 유의한 증가가 관찰되고 있어 시험물질에 의한 ALP 증가가 발모효과에 영향을 주었을 것으로 생각된다.
γ-GT는 글루타티온이나 트리펩타이드로부터 시스테인을 분리하여 케라틴 단백질을 합성하는 작용을 촉진하는 효소로서 발모주기의 성장기가 유도될 때 더 많이 발현되어 발모 표지 성분 중 하나로 제시되고 있다 28) . 본 실험에서 피부조직 내 γ-GT 활성은 실험군에서 2주차에는 유의한 차이가 없었지만 4주차에서 유의한 증가를 보여 역시 발모 효과에 영향을 주었을 것으로 생각된다.
IGF-1은 모발성장을 조절하는 가장 중요한 성장인자의 하나로 모유두 세포에서 IGF-1 생성에 남성호르몬이 직접적으로 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. IGF-1은 간엽제 세포에서만 생성되고 상피계 세포에 그 수용체가 존재하기 때문에, 모낭의 경우 모유두 세포에서 분비된 IGF-1가 상피계 세포의 증식을 촉진하고 모낭 조직의 길이를 현저히 증가시키는 것으로 알려져 있다. VEGF는 새로운 모발의 성장기로 유도하는 인자로 휴지기에 신생혈관 생성을 촉진시키는 인자로 작동한다 29) . 면역염색을 통한 관찰에서 모발성장인자인 IGF-1과 VEGF의 염색은 양성대조군을 포함한 시험물질 처치군에서 짙고 뚜렷한 다수의 양성 반점으로 관찰되고 있어 모발성장의 중요한 기전으로 작용했을 가능성을 시사하고 있다.
TGF-ß1은 상피세포의 증식을 억제 하는 쪽으로 작용하는 것으로 알려졌으며 모발이 퇴행기로 전환될 때 증가되는 인자이다. Caspase-3는 세포사멸시 활성화되는 중요한 단백질 분해효소 이므로 이 효소의 활성도를 측정하면 자가사멸정도를 파악하는 지표로 활용할 수 있다 9) . 면역염색을 통해 관찰한 모발억제인자인 TGF-ß1과 Caspase-3의 염색은 대조군에서 다수 관찰되었던 짙고 뚜렷한 양성반점이 시험물질 처치군에서 감소되는 경향으로 관찰되고 있어, 이 모발억제인자의 억제도 삼황사심탕의 모발성장 효과의 중요한 기전으로 설명되어질 수 있다.
결 론
본 연구에서는 생약복합제제중의 하나인 삼황사심탕의 추출물을 이용하여 기능성 소재로서의 적용 가능성을 확인하기 위하여 항산화효과와 육모효능실험을 실시하였다. 시험결과 식물추출물의 복합처방인 삼황사심탕은 다양한 항산화 지표에서 높은 수치를 보였으며, 기전적으로 이러한 항산화 작용과 더불어 다양한 관련 효소 및 모발 성장인자의 활성화 촉진, 모발억제인자의 발현 감소 등을 통해 모낭의 성장기를 원활하게 유지해 줌으로서 모발 촉진 효과를 보이는 것으로 생각되어지며, 추후 육모촉진 기능성 원료로 활용 가능 하리라 판단된다.
References
Stenn K.S. 2003 Molecular insights into the hair follicle and its pathology: a review of recent developments. Int J Dermatol 42 40 - 43    DOI : 10.1046/j.1365-4362.2003.01726.x
Lee I.C. , Kim B.H. , Kim M.K. 2010 Investigations of Samwhang-sasimtang extracts on biological activities in vitro and in vivo. Lab Anim Res 26 15 - 20    DOI : 10.5625/lar.2010.26.1.15
Paik J.K. , Yoon J.B. , Sim W.Y. , Kim B.S. , Kim N.I. 2001 The prevalence and types of androgenetic alopecia in Korean men and women. Br J Dermatol 45 95 - 99    DOI : 10.1046/j.1365-2133.2001.04289.x
김 휘준 , 심 우영 , 송 지영 2001 대한피부과학회지 39 1094 - 1099
Adachi K. , Kano M. 1970 Adenyl cyclase in human hair follicles: its inhibition by dihydrotestosterone. Biochem Biophys Res Commun 41 884 - 890    DOI : 10.1016/0006-291X(70)90166-X
Meister A. , Anderson M.E. 1983 Glutathione. Ann Rev Biochem 52 711 - 760    DOI : 10.1146/annurev.bi.52.070183.003431
Li L.F. , Guo J. , Gao Z.F. 2003 Overexpression of skin protein kinase C-alpha in anagen hair follicles during induced growth of mouse hair. Clin Exp Dermatol 28 429 - 433    DOI : 10.1046/j.1365-2230.2003.01328.x
Yano K. , Brown L.F. , Detmar M. 2001 Control of hair growth and follicle size by VEGF-mediated angiogenesis. J Clin Invest 107 409 - 417    DOI : 10.1172/JCI11317
Tsuboi R. 1997 Growth factors and hair growth. J Invest Dermatol 4 103 - 108
박 원석 , 성 태석 , 김 대권 , 조 원희 , 이 해광 , 이 창훈 , 박 성규 , 심 영철 2004 대한한의학회지 25 152 - 160
Datta K. , Singh A.T. , Mukherjee A. , Bhat B. , Ramesh B. , Burman A.C. 2009 Eclipta alba extract with potential for hair growth promoting activity. J Ethnopharmacol 124 450 - 456    DOI : 10.1016/j.jep.2009.05.023
張 仲景 1987 金匱要略(仲景全書 中) 행림출판사 서울 397 - 398
譚 日强 1981 金匱要略淺述 人民衛生出版社 北京 310 - 312
정 명현 , 한 성준 1996 생약학회지 27 397 - 407
이 준무 , 이 은 2003 대한약침학회지 8 51 - 57
Folin O. , Denis W. 1912 On phosphotungstic-phosphomolybdic compounds as color regents. J Biol Chem 12 239 - 243
Blois M.S. 1958 Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 181 1199 - 1200    DOI : 10.1038/1811199a0
Re R. , Pellegrini N. , Proteggente A. , Pannala A. , Yang M. , Rice-Evans C. 1999 Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Rad Biol Med 26 1231 - 1237    DOI : 10.1016/S0891-5849(98)00315-3
Marklund S. , Marklund G. 1974 Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biochem 47 469 - 474    DOI : 10.1111/j.1432-1033.1974.tb03714.x
Ferreres F. , Gomes D. , Valentano P. , Goncalves R. , Pio R. , Chagas E.A. , Seabra R.M. , Andrade P.B. 2009 Improved loquat (Eriobotrya japonica Lindl.) cultivars: Variation of phenolics and antioxidative potential. Food Chem 114 1019 - 1027    DOI : 10.1016/j.foodchem.2008.10.065
Torel J. , Cillard J. , Cillard P. 1986 Antioxidant activity of flavonoids and reactivity with peroxy radical. Phytochemistry 25 383 - 385    DOI : 10.1016/S0031-9422(00)85485-0
Wang M. , Li J. , Rangarajan M. , Shao Y. , LaVoie E.J. , Huang T.C. , Ho C.T. 1998 Antioxidative phenolic compounds fromsage (Salivia officinalis). J Agric Food Chem 46 4869 - 4873    DOI : 10.1021/jf980614b
Bannister J.V. , Bannister W.H. , Rotilio G. 1987 Aspects of the structure, function, and applications of superoxide dismutase. CRC Crit Rev Biochem 22 111 - 180    DOI : 10.3109/10409238709083738
Liu N. , Wang L.H. , Guo L.L. , Wang G.Q. , Zhou X.P. , Jiang Y. , Shang J. , Murao K. , Chen J.W. , Fu W.Q. , Zhang G.X. 2013 Chronic restraint stress inhibits hair growth via substance P mediated by reactive oxygen species in mice. PLoS One 8 (4) e61574 -    DOI : 10.1371/journal.pone.0061574
Tobin D.J. , Hagen E. , Bolchkarev V.A. , Paus R. 1998 Do hair bulb melonocytes undergo apoptosis during hair follicle regression(catagen). J Invest Dermatol 111 941 - 946    DOI : 10.1046/j.1523-1747.1998.00417.x
Müller-Röver S. , Handjiski B. , van der Veen C. , EichMüller S. , Foitzik K. , Mckay I. , Stenn K. , Paus R. 2001 A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. J Invest Dermatol 117 3 - 15    DOI : 10.1046/j.0022-202x.2001.01377.x
Iida M. , Ihara S. , Matsuzaki T. 2007 Hair cycle-dependent changes of alkaline phosphatase activity in the mesenchyme and epithelium in mouse vibrissal follicles. Dev Growth Differ 49 185 - 195    DOI : 10.1111/j.1440-169X.2007.00907.x
Hamada K. , Suzuki K. 1996 Evaluation of biochemical indices as a hair cycle marker in C3H mice. Exp Anim 45 251 - 256    DOI : 10.1538/expanim.45.251
Ozeki M. , Tabata Y. 2003 In vivo promoted growth of mice hair follicles by the controlled release of growth factors. Biomaterials 24 2387 - 2394    DOI : 10.1016/S0142-9612(03)00045-0