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Effect of White Ginseng-Ejung-tang and Red Ginseng-Ejung-tang Water Extract on Production of Chemokines and IL-21 in LPS-induced RAW 264.7 Mouse Macrophages
Effect of White Ginseng-Ejung-tang and Red Ginseng-Ejung-tang Water Extract on Production of Chemokines and IL-21 in LPS-induced RAW 264.7 Mouse Macrophages
Journal of Physiology & Pathology in Korean Medicine. 2013. Dec, 27(6): 795-801
Copyright © 2013, The Korean Association of Oriental Medical Physiology
  • Received : September 13, 2013
  • Accepted : November 27, 2013
  • Published : December 25, 2013
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완수 박
hangl98@naver.com

Abstract
The purpose of this study is to investigate effects of White Ginseng-Ejung-tang (EG) and Red Ginseng-Ejung-tang (ER) water extract on production of various cytokines such as interleukin (IL)-21, IL-25, IL-28β, erythropoietin (EPO), Exodus-2, monocyte chemotactic protein (MCP)-5, macrophage inflammatory protein (MIP)-3α, MIP-3β, Fractalkine, and TARC in RAW 264.7 mouse macrophages stimulated by lipopolysaccharide (LPS). Levels of cytokines were measured by High-throughput multiplex bead array cytokine assay based on xMAP (multi-analyte profiling beads) technology. ER significantly decreased levels of IL-21, IL-25, IL-28β, EPO, Exodus-2, MCP-5, MIP-3α, MIP-3β, TARC, and fractalkine for 24 h incubation at the oncentrations of 25 and 100 ㎍/mL in LPS-induced RAW 264.7 (P < 0.05). But EG did not show any significant effect. These results suggest that ER has anti-inflammtory property related with its inhibition on the production of IL-21, IL-25, IL-28β, and chemokines such as EPO, MCP-5, MIP-3α, MIP-3β, Fractalkine, Exodus-2, and TARC in LPS-induced macrophages.
Keywords
서 론
인삼(人蔘; Panax ginseng의 건조된 뿌리; Ginseng Radix)은 성미(性味)가 약간 따듯하고(微溫) 독이 없으며(無毒), 달면서도 약간 쓰며(甘微苦), 비폐심(脾肺心)으로 귀경(歸經)하는 것으로 알려져 있다. 1) 인삼은 우리나라의 중부지방인 경기도 강화, 포천과 충청남북도의 금산, 옥천, 영동 및 경상북도의 풍기, 영주 등에서 주로 재배된다. 1) 주로 재배한지 4~6년 후 가을에 잎이 마를 때 캐어 그늘에서 말린 것을 백삼(白蔘)이라 하고, 수염뿌리(鬚根)를 제거하고 찐 후 건조(乾燥)한 것을 홍삼(紅蔘)이라 한다. 1)
장중경(張仲景)의 상한론(傷寒論) 2) 에서 처음 ‘이중환(理中丸)’으로 제시되었던, 이중탕(理中湯)은 인삼(人蔘), 백출(白朮), 건강(乾薑), 자감초(炙甘草)로 구성되며 온중거한(溫中祛寒; 中焦를 따뜻이 하고 寒邪를 몰아냄)하고 보기건비(補氣健脾; 脾의 陽氣를 보충하고 튼튼하게 함)하는 작용을 통하여 소화장애(消化障碍), 설사(泄瀉), 자리불갈(自利不渴), 식욕의 저하, 토사곽란(吐瀉癨亂), 구역 혹은 구토, 복창(腹脹) 혹은 복만(腹滿), 배아픔 등의 소화기질환뿐만 아니라, 양허(陽虛)로 인한 코피(鼻出血), 변혈(便血), 붕루(崩漏), 흉비(胸痺), 소아만경(小兒慢驚) 등의 치료에도 널리 응용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 2 - 5)
인체의 면역염증반응(immuno-inflammatory reaction)을 담당하는 중요 세포중의 하나인 대식세포(大食細胞; macrophage)는 외부로부터의 침입하는 병원체(pathogen)에 반응하여 다양한 염증매개물질, 예를 들면 일산화질소(nitric oxide), 하이드로겐 퍼록사이드(hydrogen peroxide), 각종의 싸이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 성장인자(growth factor) 등을 배출하여 병원체를 공격, 분해하고 염증부산물과 세포잔유물들을 제거하는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 5 - 8)
본 연구에서는 백삼(白蔘)이 포함된 백삼이중탕(白蔘理中湯)의 물추출건조물(EG)과 홍삼(紅蔘)이 포함된 홍삼이중탕의 물추출건조물(ER)을 대상으로 지질다당체(lipopolysaccharide; LPS)로 촉발된 마우스대식세포 RAW 264.7이 배출하는 싸이토카인 및 케모카인 중 interleukin(IL)-21, IL-25, IL-28β, erythropoietin(EPO), Exodus-2, monocyte chemotactic protein(MCP)-5, macrophage inflammatory protein(MIP)-3α, MIP-3β, Fractalkine, TARC 등의 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 in vitro 실험을 수행하여 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
재료 및 방법
- 1. 재료
- 1) 시약 및 기기
본 실험에 사용된 시약 중 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), heat-inactivated fetal bovine serum(FBS), penicillin and streptomycin, phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.4)은 Gibco BRL사(NY, USA)에서, multiplex cytokine assay kit는 Panomics사(CA, USA)로부터 구입하였으며, 기타 시약은 Sigma-Aldrich사(MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다 5) . 각 시약의 품질은 분석용 등급 이상의 것으로 하여 사용하였으며 본 실험에 사용된 기기는 CO 2 incubator(NUAIRE, USA), clean bench(Jeiothec, Korea), rotary vacuum evaporator(Eyela, Japan), research microscope(Becton dickinson, USA), centrifuge(Gyrozen, Korea), water bath(Sae Han, Korea), vortex mixer(Vision Scientific Co, Korea), freeze dryer(Eyela), deep freezer(Gudero, Ilshin Lab, Korea), Bio-plex 200(Bio-Rad) 등이다 5) .
- 2) 약재
본 실험에 사용된 약재 중 홍삼(紅蔘)은 한국인삼공사(대전, 한국)으로부터 구입하였으며, 백삼(白蔘), 백출(白朮), 건강(乾薑), 감초(甘草)는 옴니허브주식회사(대구, 한국)로부터 구입한 후 검정하였으며 검정된 약재들은 가천대학교 한의과대학 병리학교실에 보관되었다. 5)
- 2. 방법
- 1) 시료의 제조
시료의 제조는 이미 보고한 선행연구 4 , 5 , 10 , 11) 의 방법에 따라 다음과 같이 시행하였다. 홍삼(紅蔘), 백출(白朮), 건강(乾薑), 감초(甘草) 각 12.5 g을 혼합하여 얻은 홍삼이중탕(紅蔘理中湯) 50 g과 백삼(白蔘), 백출(白朮), 건강(乾薑), 감초(甘草) 각 12.5 g을 혼합하여 얻은 백삼이중탕(白蔘理中湯) 50 g을 각각 전기약탕기에 1차 증류수 1,000 mL와 함께 넣은 뒤 150분 동안 가열, 추출하였다. 추출이 끝난 뒤 각 추출액을 filter paper(Advantec No.2, Japan)로 감압 여과한 뒤, 여과액을 rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축하였다. 이 농축액을 동결건조기를 이용하여 건조, 홍삼이중탕의 시료용 물추출동결건조물(ER)과 백삼이중탕의 시료용 물추출동결건조물(EG)을 제조하여 실험에 사용하였다. 감초(甘草)는 추출하기 전에 열을 가하여 자감초(炙甘草)로 만든 후 사용하였다 4 , 5 , 10 , 11) .
- 2) Cell line
실험에 사용된 대식세포는 mouse macrophage(RAW 264.7 cell line)이며, 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 구입하였다.
- 3) 세포 배양
세포의 배양은 이미 보고된 선행연구 4 - 5 , 10 - 11) 의 방법에 따라 다음과 같이 시행하였다. RAW 264.7 cells은 37℃, 5% CO 2 조건에서 10% FBS, penicillin(100 U/mL), streptomycin(100 ㎍/mL)이 첨가된 DMEM 배지로 75 cm2 flask (Falcon, USA)에서 배양되었다. 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 phosphate buffered saline(Sigma, USA) 용액으로 씻어주며 충분히 증식되면, 50 mL flask 당 1 mL의 0.25% trypsin-EDTA용액을 넣고 실온에서 1분간 처리한 다음 trypsin용액을 버리고 37℃에서 5분간 보관하고 세포를 탈착하여 계대 배양하였다. 탈착된 세포는 10% FBS가 첨가된 DMEM 배양액 10 mL에 부유시킨 다음, 새로운 배양용기에 옮겨 1 : 2의 split ratio로 CO 2 배양기(37℃, 5% CO 2 )에서 배양하였다 4 , 5 , 10 , 11) .
- 4) 멀티플렉스 싸이토카인 분석(multiplex cytokine assay)
LPS로 활성화된 RAW 264.7 cells의 각종 cytokine 생성과 관련된 시료의 영향을 알아보기 위해 선행연구 9 , 10) 의 방법을 참고하여 다음과 같이 실험을 시행하였다. 96 well plate에 1×10 4 cells/well의 농도로 분주되도록 1×10 5 cells/mL의 cell을 100 μL 씩 넣고 37℃, 5% CO 2 incubator에서 24시간동안 배양한 후, 배지를 버리고 배양세포 표면을 PBS용액으로 씻어준 뒤, LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 배지에 녹인 시료와 함께 각 well에 처리하고 24시간 동안 배양한다. 9 , 10) 배양이 끝나면 상층액을 채취하여 다음의 멀티플렉스어세이를 실시하는 데, 세포배양 상층액을 분주하기 전에 96 well plate 타입의 Filter plate를 wash buffer로 세척 후, 특정항체가 결합되어 있는 beads를 분주한 후 다시 한번 wash buffer로 세척하고 세척이 끝나면 세척액을 모두 제거한 후 준비된 세포배양상층액과 표준물질(standard antibody)을 각 well에 50 μL씩 분주한다. 9 , 10) 분주가 끝나면 실온에서 30분간 500 rpm의 속도로 shaking하며, 30분간의 shaking incubation이 끝나면 wash buffer를 이용, 3회의 세척을 실시한다. 9 , 10) 세척이 끝나면 세척액을 모두 제거한 후 미리 혼합된 Detection Antibody를 각 well에 25 μL씩 분주하고 실온에서 30분간 500 rpm의 속도로 shaking한 뒤, 30분간의 shaking incubation이 끝나면 wash buffer를 이용, 3회의 세척을 실시한다. 9 , 10) 세척이 끝나면 세척액을 모두 제거한 후 미리 잘 섞인 Streptavidin-PE를 각 well에 50 μL씩 분주하고 실온에서 30분간 500 rpm의 속도로 shaking하며, 30분간의 shaking incubation이 끝나면 wash buffer를 이용, 3회의 세척을 실시하고 세척이 끝나면 세척액을 모두 제거한 후 각 well에 Reading buffer를 120 μL씩 분주하고 실온에서 5분간 500rpm의 속도로 shaking한 후 Bioplex-200을 이용, 각 cytokine의 생성수준을 측정, 비교한다. 4 , 5 , 10 , 11)
- 3. 통계처리
실험성적은 평균치 ± 표준오차 (Mean ± SEM)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균 차이는 Student t-test로 분석하여 P < 0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
결 과
- 1. LPS로 촉발된 RAW 264.7의 IL-21 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 준비된 시료 EG(25, 100 ㎍/mL), ER(25, 100 ㎍/mL)과 함께 RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 처리한 결과 LPS로 인한 IL-21 생성증가를 ER이 25, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰으나, EG는 유의한 영향을 나타내지 않았다( Fig. 1 ).
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Effect of EG and ER on production of IL-21 in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL), EG, and ER for 24 h. Results are represented as mean ± SEM of three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. EG25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of EG. EG100 : treated with LPS and 100 ㎍/mL of EG. ER25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of ER. ER100: treated with LPS and 100 ㎍/mL of ER. * represents P < 0.05 compared to Control.
- 2. LPS로 촉발된 RAW 264.7의 IL-25 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 준비된 시료 EG(25, 100 ㎍/mL), ER(25, 100 ㎍/mL)과 함께 RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 처리한 결과 LPS로 인한 IL-25 생성증가를 ER이 25, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰으나, EG는 유의한 영향을 나타내지 않았다( Fig. 2 ).
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Effect of EG and ER on production of IL-25 in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL), EG, and ER for 24 h. Results are represented as mean ± SEM of three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. EG25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of EG. EG100 : treated with LPS and 100 ㎍/mL of EG. ER25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of ER. ER100: treated with LPS and 100 ㎍/mL of ER. * represents P < 0.05 compared to Control.
- 3. LPS로 촉발된 RAW 264.7의 IL-28β 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 준비된 시료 EG(25, 100 ㎍/mL), ER(25, 100 ㎍/mL)과 함께 RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 처리한 결과 LPS로 인한 IL-28β 생성증가를 ER이 25, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰으나, EG는 유의한 영향을 나타내지 않았다( Fig. 3 ).
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Effect of EG and ER on production of IL-28β in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL), EG, and ER for 24 h. Results are represented as mean ± SEM of three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. EG25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of EG. EG100 : treated with LPS and 100 ㎍/mL of EG. ER25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of ER. ER100: treated with LPS and 100 ㎍/mL of ER. * represents P < 0.05 compared to Control.
- 4. LPS로 촉발된 RAW 264.7의 EPO 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 준비된 시료 EG(25, 100 ㎍/mL), ER(25, 100 ㎍/mL)과 함께 RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 처리한 결과 LPS로 인한 EPO 생성증가를 ER이 25, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰으나, EG는 유의한 영향을 나타내지 않았다( Fig. 4 ).
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Effect of EG and ER on production of EPO in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL), EG, and ER for 24 h. Results are represented as mean ± SEM of three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. EG25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of EG. EG100 : treated with LPS and 100 ㎍/mL of EG. ER25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of ER. ER100: treated with LPS and 100 ㎍/mL of ER. * represents P < 0.05 compared to Control.
- 5. LPS로 촉발된 RAW 264.7의 Exodus-2 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 준비된 시료 EG(25, 100 ㎍/mL), ER(25, 100 ㎍/mL)과 함께 RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 처리한 결과 LPS로 인한 Exodus-2 생성증가를 ER이 25, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰으나, EG는 유의한 영향을 나타내지 않았다( Fig. 5 ).
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Effect of EG and ER on production of Exodus-2 in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL), EG, and ER for 24 h. Results are represented as mean ± SEM of three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. EG25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of EG. EG100 : treated with LPS and 100 ㎍/mL of EG. ER25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of ER. ER100: treated with LPS and 100 ㎍/mL of ER. * represents P < 0.05 compared to Control.
- 6. LPS로 촉발된 RAW 264.7의 MCP-5 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 준비된 시료 EG(25, 100 ㎍/mL), ER(25, 100 ㎍/mL)과 함께 RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 처리한 결과 LPS로 인한 MCP-5 생성증가를 ER이 25, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰으나, EG는 유의한 영향을 나타내지 않았다( Fig. 6 ).
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Effect of EG and ER on production of MCP-5 in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL), EG, and ER for 24 h. Results are represented as mean ± SEM of three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. EG25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of EG. EG100 : treated with LPS and 100 ㎍/mL of EG. ER25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of ER. ER100: treated with LPS and 100 ㎍/mL of ER. * represents P < 0.05 compared to Control.
- 7. LPS로 촉발된 RAW 264.7의 MIP-3α 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 준비된 시료 EG(25, 100 ㎍/mL), ER(25, 100 ㎍/mL)과 함께 RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 처리한 결과 LPS로 인한 MIP-3α 생성증가를 ER이 25, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰으나, EG는 유의한 영향을 나타내지 않았다( Fig. 7 ).
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Effect of EG and ER on production of MIP-3α in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL), EG, and ER for 24 h. Results are represented as mean ± SEM of three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. EG25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of EG. EG100 : treated with LPS and 100 ㎍/mL of EG. ER25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of ER. ER100: treated with LPS and 100 ㎍/mL of ER. * represents P < 0.05 compared to Control.
- 8. LPS로 촉발된 RAW 264.7의 MIP-3β 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 준비된 시료 EG(25, 100 ㎍/mL), ER(25, 100 ㎍/mL)과 함께 RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 처리한 결과 LPS로 인한 MIP-3β 생성증가를 ER이 25, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰으나, EG는 유의한 영향을 나타내지 않았다( Fig. 8 ).
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Effect of EG and ER on production of MIP-3β in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL), EG, and ER for 24 h. Results are represented as mean ± SEM of three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. EG25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of EG. EG100 : treated with LPS and 100 ㎍/mL of EG. ER25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of ER. ER100: treated with LPS and 100 ㎍/mL of ER. * represents P < 0.05 compared to Control.
- 9. LPS로 촉발된 RAW 264.7의 TARC 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 준비된 시료 EG(25, 100 ㎍/mL), ER(25, 100 ㎍/mL)과 함께 RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 처리한 결과 LPS로 인한 TARC 생성증가를 ER이 25, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰으나, EG는 유의한 영향을 나타내지 않았다( Fig. 9 ).
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Effect of EG and ER on production of TARC in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL), EG, and ER for 24 h. Results are represented as mean ± SEM of three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. EG25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of EG. EG100 : treated with LPS and 100 ㎍/mL of EG. ER25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of ER. ER100: treated with LPS and 100 ㎍/mL of ER. * represents P < 0.05 compared to Control.
- 10. LPS로 촉발된 RAW 264.7의 Fractalkine 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 준비된 시료 EG(25, 100 ㎍/mL), ER(25, 100 ㎍/mL)과 함께 RAW 264.7 세포들을 24시간 동안 처리한 결과 LPS로 인한 Fractalkine 생성증가를 ER이 25, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰으나, EG는 유의한 영향을 나타내지 않았다( Fig. 10 ).
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Effect of EG and ER on production of Fractalkine in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL), EG, and ER for 24 h. Results are represented as mean ± SEM of three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. EG25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of EG. EG100 : treated with LPS and 100 ㎍/mL of EG. ER25 : treated with LPS and 25 ㎍/mL of ER. ER100: treated with LPS and 100 ㎍/mL of ER. * represents P < 0.05 compared to Control.
고 찰
인삼의 뿌리에는 인삼사포닌(saponin; ginsenoside)이 약 5.22% 함유되어 있는데, 인삼사포닌은 13종 이상의 saponin 혼합물이며, 그 가운데서 ginsenoside Rb1, Rc 및 Rg1의 함유량이 비교적 높다. 1) saponin이 함유된 genin은 protopanxadiol, protopanaxatriol, oleanol acid의 3종이 있다. 1) 특이한 것은 protopanxadiol과 protopanaxatriol이 genin으로 조성되어 있는 인삼사포닌에는 생리활성이 있으나, olenaol acid가 genin으로 조성되어 있는 인삼사포닌에는 생리활성이 없는 것으로 알려져있다. 1) 또한 인삼의 뿌리에는 정유(精油)가 약 0.05% 함유되어있고 그 저불점부(低沸點部)에는 인삼의 독특한 향기의 근원이 되는 β-elemen이 있고, 저비점부(低沸點部)에는 극히 불안정한 액체이며 공기중에서 용이하게 수지화(樹脂化)하는 panaxynol이 또한 함유되어 있다. 1)
인삼은 대보원기(大補元氣), 고탈생진(固脫生津), 안신(安神)하는 효능을 가지고 있어서 노상허손(勞傷虛損), 식소(食少), 권태(倦怠), 반위토식(反胃吐食), 대변활설(大便滑泄), 허해천촉(虛咳喘促), 자한폭탈(自汗暴脫), 경계(驚悸), 건망(健忘), 현훈두통(眩暈頭痛), 양위(陽痿), 빈뇨(頻尿), 소갈(消渴), 부녀붕루(婦女崩漏), 소아만경(小兒慢驚), 구허불복(久虛不復), 일체(一切)의 기혈진액부족(氣血津液不足)을 치료한다고 하였다. 1)
인삼은 수치(修治)방법에 따라 백삼(白蔘)과 홍삼(紅蔘)으로 구분된다. 즉, 인삼을 재배한지 4~6년 후 가을에 잎이 마를 때 캐어 그늘에서 말린 것을 백삼(白蔘)이라 하고, 수염뿌리(鬚根)를 제거하고 찐 후 건조(乾燥)한 것을 홍삼(紅蔘)이라 한다. 1)
백삼(白蔘)은 방추형(紡錘形) 또는 원주형(圓柱形)으로 때로는 중간쯤에서 2~5개의 곁뿌리가 나누어져 있고 길이 12~20 cm, 지름 1~3 cm인데, 표면은 엷은 황갈색 또는 엷은 회갈색을 띠며 세로주름과 가는 뿌리의 자국이 있고, 두근부(頭根部)는 줄기의 잔기(殘基)가 붙어 있는 노두(蘆頭)가 있다. 1) 斷面은 거의 평탄하며 엷은 황갈색(黃褐色)이고, 형성층(形成層) 부근은 갈색(褐色)을 띤다. 백삼의 횡단면(橫斷面)을 현미경으로 보면 전분립(澱粉粒)이 가득 차 있는 박막성(薄膜性)의 유세포로 되어 있고 피부 여러 곳에 황색(黃色) 또는 황적색(黃赤色)의 분비물이 들어있는 수지도 나타난다. 1) 홍삼(紅蔘)도 외형적으로는 긴 원주형(圓柱形) 또는 방추형(紡錘形)을 이루며 중간쯤에서 2~5개의 곁뿌리가 갈라지는 것은 백삼(白蔘)과 비슷하다. 1) 홍삼(紅蔘)의 길이는 5~25 cm, 주근(主根)의 지름이 5~30 mm이며, 표면(表面)은 엷은 황갈색(黃褐色) 또는 적갈색(赤褐色)을 띠고 반투명(半透明)이며, 세로주름 및 가는 뿌리의 자국이 있다. 1) 홍삼(紅蔘)의 두근부(頭根部)는 약간 찌그러지고 짧은 줄기의 잔기(殘基)가 붙어 있으며, 단면(斷面)은 평탄하며 질(質)은 단단하고 각질(角質)이다. 1)
인삼이 포함된 많은 처방 중에서 이중탕(理中湯)은 인삼(人蔘)외에도 백출(白朮), 건강(乾薑), 자감초(炙甘草)가 추가되어 구성되는 처방으로 온중거한(溫中祛寒), 보기건비(補氣健脾)하는 효능이 있어서 리냉(裏冷)으로 인한 식욕저하(食慾低下), 소화장애(消化障碍), 설사(泄瀉), 자리불갈(自利不渴), 토사곽란(吐瀉癨亂), 구역(嘔逆) 혹은 구토(嘔吐), 복창(腹脹) 혹은 복만(腹滿), 배아픔(腹痛) 등의 소화기질환뿐만 아니라, 양허(陽虛)로 인해서 코피가 나는 것(鼻出血), 변혈(便血), 붕루(崩漏), 흉비(胸痺), 소아만경(小兒慢驚) 등의 치료에도 널리 사용될 수 있는 것으로 알려져 있다. 2 - 5)
이중탕(理中湯)에 부자(附子)를 추가된 부자이중환(附子理中丸)은 토사곽란(吐瀉霍亂), 구금(口噤), 음한중증(陰寒重證)에 적용될 수 있으며, 신기(腎氣)가 제상(臍上)에 동(動)하는 경우에는 백출(白朮)을 빼고 육계(肉桂)를 추가하며, 토(吐)하는 것이 심한 경우에는 백출(白朮) 대신에 생강(生薑)을 넣어준다고 하였고, 복통(腹痛)이 심하면 목향(木香)을 추가하며, 반위구토(反胃嘔吐)가 심한 경우에는 생강(生薑)과 반하(半夏)를 더해주거나 정향(丁香), 백두구(白荳蔲)를 더해주며, 수종(水腫)에는 복령(茯苓), 택사(澤瀉), 동과피(冬瓜皮) 등을 더하여 사용한다고 하였다. 2 - 5)
인체의 면역반응에는 중성구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, NK세포, B세포, T세포 등 많은 세포들이 관여한다. 면역반응을 담당하는 중요 세포중의 하나인 대식세포(大食細胞; macrophage)는 탐식세포(貪食細胞)라고도 불리우며, 인체외부로부터 침입하는 병원체(pathogen)에 반응하여 면역염증반응(immuno-inflammatory reaction)을 일으키는 주요한 작용을 한다. 대식세포가 인식하는 이상물질(異常物質)에는 세균, 바이러스, 진균, 프로토조아 등의 외부병원체 뿐만아니라, 인체의 부산물 중에도 노화세포, 세포의 잔유물, 비정상적인 세포 등도 포함된다. 그러므로 ‘면역기능(immunity)'이란 외부로부터 침입하는 ‘병원체’뿐만 아니라, 내부적으로 발생하는 ‘비정상적인 존재물’에 대한 ‘인지와 대응, 그리고 제거’의 과정을 포함한다고 할 수 있을 것이다. 이러한 대식세포의 ‘면역염증반응’에 있어서 중요한 매개역할을 하는 것이 바로 대식세포에 의해서 만들어지는 각종의 염증매개물질들(inflammatory mediators)이다.
염증매개물질에는 싸이토카인, 케모카인, 성장인자와 같은 단백질류들과 일산화질소, 하이드로겐 퍼록사이드 등이 있다. 인터루킨(interleukin)은 싸이토카인에 속하는 것으로 패혈증과 같은 급성염증질환 뿐만 아니라 류마티스성관절염이나 전신성홍반성낭창과 같은 자가면역성질환, 퇴행성뇌질환과 같은 만성염증성질환의 발생 및 증상악화와 관련되는 것으로 알려져 있다. 케모카인은 주화성반응(chemotaxis)을 유발하는 작은 분자량의 단백질로서 염증유발부위로 관련된 면역세포들이 집중되도록 하는 작용을 하며, 과도한 케모카인의 증가는 폐렴, 천식, 아토피피부염, 동맥경화증 등을 악화시키는 것으로 알려져 있다. 12 - 20) 그러므로 최근의 연구에서는 염증반응이 유발된 대식세포에 의해서 이루어지는 싸이토카인, 케모카인, 성장인자 등의 염증매개물질과 잉생성을 조절하는 물질이나 약물에 대한 연구가 주목을 받고있다. 9 - 11) 대식세포의 염증매개물질배출과 관련된 이중탕의 효능과 관련하여, 최근 Lee 등은 백삼이중탕물추출물 및 홍삼이중탕물추출물이 RAW 264.7에 세포독성을 유발하지 않으면서, LPS에 의해 유발된 RAW 264.7의 NO와 세포내 hydrogen peroxide 생성증가를 유의하게 감소시킴에 대해서 보고한 바 있다. 5 , 21)
본 연구에서는 백삼(白蔘)이 포함된 백삼이중탕(白蔘理中湯)의 물추출건조물(EG)과 홍삼(紅蔘)이 포함된 홍삼이중탕의 물추출건조물(ER)을 대상으로 지질다당체(lipopolysaccharide; LPS)로 촉발된 마우스대식세포 RAW264.7이 배출하는 싸이토카인 중 IL-21, IL-25, IL-28β, EPO, Exodus-2, MCP-5, MIP-3α, MIP-3β, Fractalkine, TARC의 생성에 미치는 영향에 대하여 알아보고자 하였다.
본 연구의 실험결과 홍삼이 포함된 이중탕물추출물인 ER은 LPS로 유발된 마우스 대식세포 RAW 264.7의 IL-21, IL-25, IL-28β, EPO, Exodus-2, MCP-5, MIP-3α, MIP-3β, TARC, Fractalkine의 생성증가를 25, 100 ㎍/mL의 농도에서 모두 유의하게 감소시켰다. 그러나 백삼이 포함된 이중탕물추출물 EG는 LPS로 유발된 IL-21, IL-25, IL-28β, EPO, Exodus-2, MCP-5, MIP-3α, MIP-3β, TARC의 생성증가에 대하여 유의한 변화를 나타내지 않았으며, Fractalkine의 경우 25 ㎍/mL의 농도에서 오히려 유의한 증가가 나타났다. 이와 같은 연구결과는 ER이 대식세포의 염증촉발인자과잉생성과 관련된 다양한 급성염증질환과 만성염증질환들의 완화, 예를 들면, IL-21, IL-25, IL-28β 등의 인터루킨류의 증가로 인한 패혈증의 악화, MCP-5 증가로 인한 알러지성질환의 악화, MIP-3α, MIP-3β, TARC, Fractalkine 등의 케모카인 증가로 인한 폐렴악화나 케모카인촉발성 염증질환의 악화, EPO의 증가와 관련되는 적혈구과다증의 악화를 조절할 수 있는 항염효능이 있음을 의미하는 것으로 해석될 수 있을 것이다.
결 론
본 연구에서는 LPS로 유발된 마우스 대식세포 RAW 264.7의 특이성 염증매개물질, 예를 들면 IL-21, IL-25, EPO, MCP-5 등의 증가에 대한 홍삼이중탕 물추출물(ER)과 백삼이중탕물추출물(EG)의 작용을 알아보기 위하여 in vitro 실험을 수행하였다. 실험결과 ER은 LPS로 유발된 마우스 대식세포 RAW 264.7의 IL-21, IL-25, IL-28β, EPO, Exodus-2, MCP-5, MIP-3α, MIP-3β, TARC, Fractalkine의 생성증가를 25, 100 ㎍/mL의 농도에서 모두 유의하게 감소시켰으나(P < 0.5), EG는 별다른 영향을 나타내지 않았다. 이와 같은 실험결과는 ER이 대식세포의 IL-21, IL-25, IL-28β, EPO, Exodus-2, MCP-5, MIP-3α, MIP-3β, TARC, Fractalkine 생성증가와 관련된 과잉염증반응을 조절할 수 있는 효능을 가지고 있음을 의미한다. 앞으로 ER의 항염효능규명을 위한 보다 세밀한 연구가 요구되어지는 바이다.
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