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Chrysanthemum zawadskii var. latilobum Extracts Inhibits of TPA-induced Invasion by Reducing MMP-9 Expression Via the Suppression of NF-<TEX>${\kappa}B$</TEX> Activation in MCF-7 Human Breast Carcinoma Cells
Chrysanthemum zawadskii var. latilobum Extracts Inhibits of TPA-induced Invasion by Reducing MMP-9 Expression Via the Suppression of NF-${\kappa}B$ Activation in MCF-7 Human Breast Carcinoma Cells
Journal of Physiology & Pathology in Korean Medicine. 2013. Dec, 27(6): 782-788
Copyright © 2013, The Korean Association of Oriental Medical Physiology
  • Received : November 06, 2013
  • Accepted : December 12, 2013
  • Published : December 25, 2013
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About the Authors
진기 황
정미 김
미성 김
하림 김
연주 박
용욱 유
강범 권
영래 이
mindyr@wku.ac.kr

Abstract
Chrysanthemum zawadskii Herbich var . latilobum Kitamura (Compositae), colloquially known “Gujulcho” in Korea, has been used in traditional medicine for the treatment of various diseases, including cough, common cold, bladder-related disorders, gastroenteric disorders, hypertension, and inflammatory diseases, such as pneumonia, bronchitis, pharyngitis, and rheumatoid arthritis (RA) However, the effect of Chrysanthemum zawadskii var. latilobum on breast cancer invasion is unknown. In this study, we investigated the inhibitory effect of Chrysanthemum zawadskii var. latilobum extract (CZE) on 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-induced matrix metalloproteinase-9(MMP-9) expression and cell invasion, as well as the molecular mechanisms involved in MCF-7 cells. CZE were not cytotoxic up to 100 ㎍/ml concentration in the MCF-7 cell line. CZE decreased MMP-9 expression. TPA substantially increased NF-κB DNA binding activity. Pre-treatment with CZE inhibited TPA-stimulated NF-κB binding activity and NF-κB related protein expression. To identify invasion ability of MCF-7 cells decreased by CZE, we used martrigel invasion assay. As a result, it is significantly decreased cell invasion. These results indicate that CZE-mediated inhibition of TPA-induced MMP-9 expression and cell invasion involves the suppression of the NF-κB pathway in MCF-7 cells. Chrysanthemum zawadskii var. latilobum may have potential value in restricting breast cancer metastasis.
Keywords
서 론
Carl Maximowicz에 의해 명명 되어진 Chrysanthemum zawadskii var. latilobum 의 한국 이름은 구절초이며, 구절초는 국화과 국화속에 속하는 다 년생 식물이다 1) . 구절초는 폐렴, 기관지염, 기침, 감기, 인두염, 방광 관련질환, 위장 장애, 고혈압을 치료하기위한 약으로 사용되어져 왔다 1 , 2) . 또한, 구절초는 항암, 산화, 염증과 간 보호 효과와 같은 다양한 약물 특성이 있다고 보고되었다 3 - 7) . 특히, 구절초에서 분리된 linarin과 acacetin은 항암효과와 염증에 효과가 있다고 알려져 있다 3) . 하지만, 유방암 세포에서 구절초의 암전이 억제 효과는 보고 된 바 없다. 따라서 본 연구는 유방암 세포의 전이에 있어 구절초의 효과와 작용기전을 규명하였다.
유방암은 유방을 이루는 세포에서 기원한 악성 종양세포를 말하여, 유방 내에만 머무는 양성 종양과 달리 유방 밖으로 퍼져나가 다른 장기로 전이되어 생명을 위협할 수 있는 악성 종양이다 8) . 국내 유방암 발생률은 1999년부터 2010년까지 매년 6%씩 증가하였고, 유방암 환자는 10년 동안 약 3배 가까이 증가 하였다 9 , 10) . 전이는 종양의 발생부위에서 다른 조직으로 이식된 경우를 말하며 악성종양이 갖는 대표적인 특징이다 11) . 이러한 암세포전이 억제는 종양의 외과적 치료 후 재발되는 유방암의 치료를 위해 중요한 치료 방법이다. 따라서 현재 악성종양의 침윤이나 전이를 억제하기 위한 효과적인 치료 약물 개발이 계속해서 연구되고 있다 12) .
암세포의 침윤과 전이는 매우 복잡하며 연속적인 분자적 기전들에 의해 유발된다. 암세포가 다른 장기로 침윤이나 전이가 일어나기 위해서는 암을 둘러싸고 있는 조직들을 효과적으로 분해하여 암세포가 빠져 나갈 수 있는 공간을 확보해야하는데 이를 위해 암세포는 주위 조직의 세포외 기질 (extracellular matrix)을 파괴할 수 있는 단백질 분해 효소를 분비한다 13 , 14) . 암세포가 분비하는 대표적인 단백질 분해 효소는 matrix metalloproteinases (MMPs)가 있으며, MMPs의 과발현은 암세포주위 조직의 세포외 기질을 빠르게 파괴하고 암세포가 전신 순환계로 들어가는데 큰 역할을 하고 있다. 따라서 MMPs의 과발현은 암 전이 발생에 영향을 주는 요인 중 하나라고 여길 수 있으며, MMPs의 측정은 암의 예후를 예상하고 치료를 선택하는데 이용될 수 있음을 알려준다 15 , 16) .
MMPs는 현재까지 약 24가지 이상 존재한다고 알려져 있으며 기질의 특이성, 억제제의 결합부위, 기질의 결합부위, 그리고 세포막에서의 존재 위치에 따라 크게 collagenase, stromelysins, gelatinasese, matrilysin의 4가지 군으로 구분된다 17) . 이런 MMPs 중 Type IV collagenase인 MMP-2 및 MMP-9은 암세포에서 과발현 되면 암세포 주위 조직의 기저막을 분해하며 암세포의 전이, 침윤 및 신생혈관 생성을 활성화시키는 것으로 알려져 있다 18) . 특히, MMP-9은 유방의 정상 혹은 양성 종양세포에서는 관찰되지 않고 주로 유방암 세포에서 관찰된다는 보고가 있으며 19) , 뇌암 20) , 전립선 암 21) , 방광암22)의 침윤 및 전이가 발생 될 때 과발현 된다고 보고되고 있다.
이 연구에서 우리는 구절초 추출물이 유방암의 전이를 강력하게 억제하는 것을 새롭게 밝혀냈으며, 이는 구절초 추출물이 유방암의 전이를 억제하거나 치료하는데 사용될 수 있는 하나의 생약 후보가 될 수 있음을 제시하는 바이다.
재료 및 방법
- 1. 세포배양 및 재료
MCF-7 세포주는 미국 세포 주 은행(American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA; catalog no. CRL-2749)에서 구입해서 사용하였으며, 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 U/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin을 함유한 DMEM 배지에서 5% CO 2 를 함유하며, 37℃를 유지하는 세포 배양기에서 배양하였다. 95% 메탄올 구절초 추출물은 Korea Plant Extract Bank (Daejeon, Korea)에서 구입하였다. TPA, 3-(4,5-dimethyl-thiazol -2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) and anti-β-actin antibody는 Sigma-Aldrich(St.Louis, MO, USA)에서 구입하였다. IKKα, IKKβ, p-IKKα/β, p-Iκ Bα 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. MMP-9, p50, p65, IκBα and proliferating cell nuclear antigen(PCNA), and horseradish peroxidase(HRP)-conjugated IgG 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. [c32-P]ATP는 Amersham(Buckinghamshire, UK)에서 구입하였다. High glucose-containingDMEM, FBS and phosphate-buffered saline(PBS) 는 Gibco-BRL(Gaithersburg, ME, USA)에서 구입하였다.
- 2. 세포 독성 실험(MTT assay)
MCF-7세포에 대한 구절초 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실행하였다. 간략히 설명하자면, MCF-7 세포를 3×10 4 cells/㎖의 농도로 96 well plate에 분주한 후 다양한 농도의 구절초 추출물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 정해진 시간 동안 구절초 추출물을 처리한 후 PBS로 wash한 다음 MTT 시약 10 ㎕(0.5 ㎎/㎖ PBS)를 첨가한 후 37℃에서 30분간 배양한 후 DMEM 100 ㎕/well 을 첨가한 후 ELISA reader(Molecular Device, USA)로 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 3. 웨스턴 블롯(Western blot analysis)
MCF-7 cells(5 × 10 5 )에 구절초 추출물 25, 50, 100 ㎍/ml을 1시간 전처리 후에 TPA를 처리하고 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 세포내 단백질은 Mammalian Protein Extraction Reagent(M-PER; Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 사용하여 분리하였다. 단백질의 농도는 Bradford method을 사용하여 조사하였다. 샘플(20 ㎍)은 10% acrylamide와 함께 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 사용하여 분리하였고, Hybond ™-polyvinylidene fluoride membranes(GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 이동하였다. 각각의 membrane은 2% bovine serum albumin 또는 5% skim milk 를 사용하여 2시간 동안 블록킹 하였고, 일차항체 처리 후 4℃ 냉장고에서 overnight 하였다. 이차항체는 HRP-conjugated IgG(1:2000 dilution)를 사용하였다. 단백질 발현양은 image analyzer(Fuji-Film, Tokyo, Japan)를 사용하여 확인하였다.
- 4. 효소활성 측정실험(Gelatin zymography assay)
MCF-7 cells(5 × 10 5 )에 구절초 추출물 25, 50, 100 ㎍/ml을 1시간 전처리 후에 TPA를 처리하고 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양된 세포의 조건배지를 모은 후 non-reducing sample buffer에 섞어 polyacrylamide gel containing 0.1%(w/v) gelatin로 전기영동 하였다. 그 다음 겔은 실온에서 30분 동안 2.5% Triton X-100 solution으로 두 번 wash한 뒤 incubated at 5 mM CaCl 2 , 0.02% Brij, 50mM Tris–HCL(pH 7.5) 완충액에 넣고 37°C에서 16시간 동안 인큐베이션 하였다. 젤은 0.25%(w/v) Coomassie brilliant bluein 40%(v/v) methanol 7%(v/v) aceticacid로 염색하였고 photographedon an image alyzer(Fuji-Film)를 사용하여 이미지를 촬영하였다.
- 5. Total RNA 분리 및 실시간 역전사 효소 중합반응(Real Time reverse transcriptase-PCR)
실험이 끝난 MCF-7 세포로부터 total RNA의 분리는 Trizol reagent(Life Technologies, UK)를 이용하여 제조회사가 제공하는 방법에 따라 수행하였다. 각각의 세포를 원심분리하여 모은 후 500 ㎕ RNAzol B로 용해시킨후 50 ㎕ chloroform을 첨가하여 얼음 속 에서 5분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 13,000rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 상층액을 새로운 tube에 옮겼다. 위상층액에 동량의 isopropanol을 첨가하여 섞은 후 얼음에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 13,000rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 침전물을 80% EtOH로 세척하였다. 세척된 RNA를 건조시킨 후 DEPC가 처리된 증류수 20 ㎕로 녹이고 분광광도계에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 역전사 반응(reverse transcription reaction)은 3-5 ㎍ total RNA와 reverse transcriptase Fast Pure TMRNA Kit(TaKaRa, Shiga, Japan)를 이용하여 제조회사에서 제공하는 방법에 따라 수행하였다. 역전사반응은 total RNA(3-5 ㎍), oligo d(T)12-18(1 ㎍), 2 ㎕ dNTP(10 mM), MMLV reverse transcriptase(200 U), DTT(10 mM), RNase inhibitor(1 ㎕; Promega, USA), 20 ㎕ 완충용액(50 mM Tris-Cl pH 8.3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl 2 )에 함유된 반응액으로 42℃에서 60분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 실시간 역전사 효소중합 반응은 10배 희석한 cDNA에 역전사 효소가 포함된 2X SYBR-Green 완충용액(Roche Diagnostics Ltd, UK)를 반응시켜 LightCycler rapid thermal cycler system(Roche)을 이용하여 수행하였다. 간략히 설명하자면, reaction mixture을 10분 동안 95℃에서 반응 시킨 후, denaturation(95℃, 10초), annealing(58℃ for MMP-9 or 60℃ for GAPDH, 5초), elongation(72℃, 10초)의 조건에서 45 cycles을 수행하였다. 발현된 각각 유전자의 mRNA양은 LightCycler System software(Roche)를 이용하여 GAPDH에 대한 상대적인 양으로서 계산하였다. 실험에 사용된 MMP-9과 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) mRNA의 발현( Table 1 )은 ABI PRISM 7900 sequence detection system과 SYBRÒ Green(Applied Biosystems, FosterCity,CA,USA)을 사용하여 분석하였다.
Nucleotide sequences of the primers used for real-time PCR in this study
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Nucleotide sequences of the primers used for real-time PCR in this study
- 6. 핵단백질 추출(Preparation of nuclear extract) 및 Electrophoretic mobility shift assay(EMSA)
MCF-7 cells(2 × 10 6 )에 구절초 추출물을 1시간 전처리 후에 TPA를 처리하고 37℃배양기에서 4시간 동안 배양하여 수확하였다. 수확한 뒤 즉시 ice-cold PBS(pH 7.5)를 사용하여 2번 wash하였다. 세포는 NE-PERÒ Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)을 사용하여 Cytoplasmic 과 nuclear extracts로 분리하여 추출하였다. NF-κB의 활성은 핵단백질을 추출하여 gel mobility shift assay로 측정하였다. NF-κB (κB, 5’-CCGGTTAACAGAGGGGGCTTTCCGAG-3’)을 포함하고 있는 oligonucleotide 결합부위는 gel retardation assay를 통해 probe를 사용하여 합성하였다. 두 가지의 상보적은 DNA가닥은 (10 ㎍ of nuclear extracts) annealed 되었고, [α-32P] dCTP.Labeled oligonucleotides(10,000 cpm)으로 label되었으며, binding buffer(10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 500 mM KCl, 10 mM EDTA, 50% glycerol, 100 ng poly(dI·dC), 1 mM dithiothreitol)와 섞어 실온에서 30분 동안 정치시킨 뒤 5x 쌤플버퍼와 섞어 최종적으로 20 ㎕가 되도록 만들었다. 이 action mixtures는 0.5X Tris-borate buffer속에 4% polyacrylamidegels를 넣고 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 뒤 젤은 3M paper에 드라이시킨 후 autoradiography에 의해 결과를 측정하였다.
- 7. Invasion assay
Invasion assay는 matrigel을 DMEM으로 희석하여 20 ㎕로 코팅된 24-well chambers (8-μm pore size)로 수행하였다. Matrigel 코팅은 실험 전 30분 동안 DMEM 0.5㎖로 수화하였다. 세포(2 x 10 5 /well)는 upper chamber에 seeding 하였고, bottom well 은 DMEM에 화학 유도물질을 희석하여 분주 하였다. 조건배지(0.5 ㎖)는 invasion chamber의 아래 부분에 분주하였다. Chamber는 24시간 동안 37℃배양기에서 배양하였다. 배양 후, chamber의 위쪽에 위치한 세포들은 cottons wabs를 사용하여 제거하였고, invasion된 세포들은 고정액으로 고정한 뒤 toluidine blue solution을 사용하여 염색하였다.
- 8. 통계처리
실험결과의 각 실험군은 6번 이상 반복 실시하였으며 그룹 간 유의성 검정은 One-way ANOVA Duncan 사후검정 비교를 실시하여 p<0.05일 때 유의한 것으로 판정하였다(SPSS V12. USA).
결 과
- 1. 세포독성
MCF-7세포에서 구절초 추출물(CZ extracts)의 세포독성은 MTT assay를 사용하여 확인하였다. 96-well culture plate에 MCF-7 cells을 3×10 4 cells/well의 농도로 넣어준 다음 24시간 후에 구절초 추출물을 25, 50, 100 ㎍/ml을 처리 하였다. 다시 24시간 후에 세포독성을 확인한 결과 구절초 추출물이 첨가된 모든 농도에서 세포의 생존에 영향을 미치지 않았음을 확인하였다( Fig. 1 ).
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CZE effects on MCF-7 viability. To cytotoxicity test of CZE, cells were cultured in 96-well plates until 70% confluence and various concentrations (0, 25, 50 and 100 μg) of CZ extracts were added to cells for 24h. MTT assay was used to detect the viability of the cells. The optical density value of control was regarded as 100%. Data represents are the mean ± SEM of three independent experiments.
- 2. MCF-7 세포에서 TPA-자극 MMP-9발현 확인
TPA는 PKC, MAPKs, PI3K/Akt pathways, NF-κB와 같은 전자조절 인자를 활성화시켜 MMP-9의 발현을 촉진하여 MCF-7의 침투능력을 증가시킨다. MCF-7세포에서 TPA-자극 MMP-9 발현과 구절초 추출물의 효과를 확인하기 위해 western blot analysis, real-time PCR 그리고 zymography를 이용하였다. 구절초 추출물(25, 50, 100 ㎍/ml)은 MCF-7 세포에 TPA를 처리하기 한 시간전에 처리 하였으며 TPA(20 nM)를 처리하고 24시간 후에 세포들을 수집하여 단백질을 분리하였다. 그 결과, MCF-7세포에 TPA를 처리 하면 MMP-9의 발현이 증가 되었으나 구절초 추출물을 처리하였을 경우 농도에 의존적으로 MMP-9의 발현이 감소되는 것을 확인하였다( Fig. 2 A). MMP-9의 발현이 RNA level에서도 조절 되는지 real-time PCR로 확인한 결과 단백질 발현과 마찬가지로 구절초 추출물의 농도에 의존적으로 mRNA level이 감소한 것을 확인하였다( Fig. 2 B). 또한 zymography를 이용한 MMP-9 효소활성 실험 역시 똑같은 결과를 도출할 수 있었다( Fig. 2 C). 따라서, 구절초 추출물이 MCF-7세포에서 TPA-자극 MMP-9의 발현을 강력하게 억제하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
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CZE inhibits TPA-induced MMP-9 expression in MCF-7 cells. MCF-7 cells in monolayer were treated with the indicated CZE concentrations in the presence of TPA for 24 h. The expression of MMP-9 in the cells was analyzed by Western blotting.. The blot was reprobed with anti-β-actin to confirm equal loading (A). MMP-9 mRNA levels were analyzed by real-time PCR and GAPDH was used as an internal control (B). Conditioned medium was prepared and used for gelatin zymography. Effects of CZE on the MMP-9 activity in MCF-7 cells. Cells were pretreated with CZE for 1h followed by TPA stimulation for 24h (C). Each value represents the mean ± SEM of three independent experiments. *p<0.01 vs. TPA.
- 3. TPA-자극 NF-κB DNA binding activity 측정
MCF-7 세포에서 TPA-자극에 의한 MMP-9의 발현이 NF-κB의 활성의 의한 것인지 EMSA를 사용하여 확인하였다. 그 결과 MCF-7 세포는 TPA-자극에 의해 NF-κB의 활성이 증가 하였고, 구절초 추출물을 처리 하였을 때 NF-κB의 활성이 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였다( Fig. 3 A). 또한 구절초 추출물에 의해 NF-κB의 subunit인 p65와 p50이 감소하는 것을 확인하였다( Fig. 3 B). IκBα는 NF-κB 전사인자를 억제시키는 단백질로 IKK에 의해 인산화되어 NF-κB와 분리된다 23) . 따라서 구절초 추출물에 의해 IκBα의 인산화와 NF-κB의 상위 신호전달경로인 IKK 신호전달경로가 조절 되는지 확인 하였다. 그 결과, 구절초 추출물은 TPA-자극 되어진 NF-κB의 활성에서 IKKα와 IKKβ의 발현량에 영향을 주지 않았지만 IKKαβ의 인산화를 억제하였고, IκBα의 경우 TPA를 처리한 MCF-7 세포에서는 분해되었으나 구절초 추출물을 처리한 군에서는 IκBα의 분해가 일어나지 않았다. 그리고 TPA를 처리한 MCF-7 세포는 IκBα의 인산화가 증가하였으나 구절초 추출물을 함께 처리하였을 경우 IκBα의 인산화가 억제되었다( Fig. 3 C). 이러한 실험결과는 MCF-7 세포에서 구절초 추출물이 p-IKKαβ와 p-IκBα의 감소를 통해 NF-κB의 활성을 억제함으로써 TPA에 의한 MMP-9 발현 조절 가능성을 보여준다.
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CZE inhibits TPA-induced NF-κB activation and phosphorylation of IKK/αβ in MCF-7 cells. Cells were treated with CZE in the presence of TPA. Following 4 h incubation, nuclear extracts were prepared. NF-κB DNA binding was analyzed by EMSA (A). Western blotting was performed to determine the cytoplasmic levels of p-IKKaβ, IKKa, IKKβ, p-IκBα, and IκBα, as well as the nuclear levels of NF-κB (p50 and p65) (B, C).
- 4. TPA-자극 MCF-7 cell 전이능 확인
구절초 추출물이 TPA-자극에 의한 MCF-7 세포의 침투를 억제하는지를 확인하기 위해 in vitro Matrigel invasion assay를 실시하였다. MCF-7 세포를 TPA로 자극 하였을 경우 TPA를 자극하지 않았을 때보다 전이가 10-fold가 증가한 것을 확인 할 수 있었다. 하지만 구절초 추출물을 함께 처리했을 경우 MCF-7의 침투능력이 약 80%가 감소되는 것을 확인 할 수 있었다( Fig. 4 ).
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CZE (100 ㎍/ml) inhibits TPA-induced Matrigel invasion in MCF-7 cells. Cells were seeded onto the upper chamber and drugs placed in the well. After a 24 h incubation, cells on the bottom of filter were fixed, stained, and counted. Each value represents the mean ± SEM of three independent experiments. *p<0.01 vs. TPA.
고 찰
구절초( Chrysanthemum zawadskii var. latilobum )는 국화과 국화속에 속하는 다년생 식물이며 전초의 생약명은 선모초(仙母草), 구절초(九折草)라 하며, 개화기는 8-10월이다 6) . 구절초는 우리나라 전국 각처의 산지와 고원지에서 자생하고 중국, 러시아, 몽골, 일본 등 아시아 및 유럽에서 자라며 전통적으로 줄기와 잎을 가을에 취하여 환의 형태, 혹은 달여서 복용하였다 24) . 구절초 전초와 꽃 그리고 이삭은 폐렴, 기관지염, 기침, 감기, 인두염, 방과질환, 부인병, 냉증, 위장병 및 고혈압 등에 사용되어져왔다 2 , 24) . 구절초의 함유성분으로는 항암, 항염증, 간보호작용을 갖는 플라보노이드계의 linarin과 acacetin이 보고되고 있다 25 , 29) . 구절초를 methanol로 추출 하였을 때의 주요성분은 linarlin이라고 알려져 있으며 linarin는 항염증 작용과 해열작용 및 간 보호작용이 있다고 보고되어지고 있다 6) . 또한 acacetin은 구절초의 chloroform 분획물이며 결장암세포와 신장암세포에서 세포독성을 나타내었다고 보고되었다 30) .
우리는 예전의 논문에서 구절초 추출물이 MAPK와 NF-κB pathway를 억제하여 파골세포의 분화를 억제한다는 보고를 하였다 31) . NF-κB와 AP-1은 MMP-9을 조절하는 중요한 전사조절 인자이며, DNA의 NF-κB와 AP-1 결합자리는 MMP-9 gene promoter를 포함하고 있다 32) . NF-κB와 AP-1 elements는 TPA-mediated MMP-9 유전자 발현에 중추적인 역할을 한다 33 , 34) . 대식세포의 파골세포로의 분화 과정에서 구절초 추출물이 NF-κB pathway를 억제하는 현상을 확인하고 유방암 세포의 MMP-9발현과 침윤을 억제할 수 있을 것이라고 예상하였다.
유방암은 전 세계의 여성에게서 발병되는 암 중 두 번째로 높게 발생되는 심각한 질환이며 우리나라에서도 10년 사이에 약 3배 정도가 지속적으로 증가하고 있다 9 , 10) . 유방암 환자에게 수술요법이나 방사선 치료 또는 약물 요법을 사용하여 치료를 시도하고 있지만 여전히 유방암에 의한 사망률은 높은 편이다. 유방암의 완치가 어려운 가장 큰 이유는 암세포의 전이 때문이다. 따라서, 현재 유방암 치료와 전이억제에 대한 연구는 전 세계 의학계의 중요한 연구과제가 되고 있다.
구절초 추출물을 사용하여 유방암의 억제 기전을 확인하고자 한 이번연구에 첫 번째로 실시한 실험은 세포 독성에 대한 평가였다. 구절초 추출물이 유방암 세포주인 MCF-7 세포에 독성을 나타내지는지 확인하기 위해 세포독성 실험을 실행한 결과 구절초 추출물은 고농도(100 ㎍/ml)에서도 세포독성을 나타내지 않았다. 다음 실험으로 MCF-7 세포에서 TPA-자극에 의한 MMP-9의 발현을 구절초 추출물이 조절할 수 있는 지를 조사하였다. MMPs(matrix metalloproteinases)는 여러 암종에서 분비되며 콜라겐이나 젤라틴을 분해하여 암세포의 이동과 전이를 촉진시키는 중요한 효소로 알려져있다 35 - 37) . 현재까지 약 24가지 이상의 MMPs가 알려져 있으며, 이들 중 특히 Type IV collagenase인 MMP-2 및 MMP-9은 암세포의 전이와 침윤 발생 시 기저막을 분해하며 암세포의 전이, 침윤 및 신생혈관 생성을 활성화시키는 역할을 한다고 알려져 있다 17) . 구절초 추출물은 MCF-7 세포에서 MMP-9의 발현을 단백질 레벨과 mRNA 레벨에서 강력하게 억제하는 효과를 보였다. 또한 MMP-9의 효소 활성 역시 구절초 추출물에 의해 억제 되는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과 구절초 추출물이 MCF-7 세포에서 TPA-자극에 의해 발현되는 MMP-9을 억제한다는 증거를 확보할 수 있었다.
MCF-7 세포에 TPA 처리는 여러 가지 생화학적 신호를 활성화시킨다. MCF-7 세포에서 TPA에 의한 MMP-9 발현에 중요한 영향을 미치는 전사조절인자로는 AP-1와 NF-κB가 잘 알려져 있다 38 , 39) . 본 연구에서는 NF-κB 활성에 의한 MMP-9 발현을 조사 하였다. NF-κB는 다양한 이유로 항암제 개발에 있어 이상적인 연구대상으로 알려져 있다. 암세포에서 NF-κB의 활성은 세포자살을 억제하면서 재생을 유도하거나 40 , 41) , 항암제에 대한 내성을 유도 40) 하며, 암의 발생과 촉진 및 전이40,42)에도 관련되어 있다. EMSA를 사용해 NF-κB의 활성을 확인한 결과 구절초 추출물은 TPA자극된 MCF-7 세포의 NF-κB 활성을 강력히 억제하는 효과를 보였다. 또한 NF-κB의 억제인자로 알려진 IκBα(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha)는 IKK(IκB kinase)에 의해서 인산화 되어 지며, IKK의 활성 억제는 NF-κB활성 억제와도 밀접하게 관련되어 있다. 따라서 구절초 추출물이 IKK/αβ, IκBα의 인산화를 억제하는 것을 확인하였다. 따라서 구절초 추출물은 MCF-7 세포에서 NF-κB의 활성을 억제하여 MMP-9의 발현을 억제한다는 결론을 얻을 수 있었다.
오늘날 여러 암에 대한 진단요법, 수술요법과 치료법이 급진적으로 발전 하였음에도 불구하고 유방암을 포함한 여러 암은 전이에 의해 암의 재발하는 등 환자의 치료에 어려움이 있다. 따라서 암의 전이를 억제하거나 늦출 수 있는 치료약의 개발은 암환자의 생명을 연장시킬 수 있는 중요한 치료적 접근이 될 것으로 여겨지고 있다. 결국, 구절초 추출물은 여러 종류의 암 전이를 억제할 수 있는 하나의 생약 후보가 될 수 있을 것으로 사료된다.
결 론
구절초 추출물의 항전이 효과를 검증하기 위한 첫 단계로 MCF-7 세포에 대한 세포독성을 확인하였다. 구절초 추출물을 MCF-7 세포에 농도별로 처리 하여 세포독성 여부를 확인한 결과 모든 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다. TPA-자극에 의한 MMP-9의 발현에서 구절초 추출물은 농도에 의존적으로 MMP-9의 발현을 억제하였고, 효소 활성역시 감소시켰다. MMP-9의 발현과 직접적인 관련이 있는 NF-κB의 활성역시 구절초 추출물에 의해 억제되는 것을 확인 할 수 있었으며, 최종적으로 MCF-7 세포의 전이에도 억제 효과를 보이는 것을 확인하였다. 따라서, 구절초 추출물에 대한 전임상연구 근거를 창출하기 위하여 향후 동물실험을 통한 효능검증이 필요할 것으로 사료된다.
Acknowledgements
이 논문은 2012학년도 원광대학교의 교비지원에 의해서 수행 됨.
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