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Verification of Estrogen Like Activities of Herbal Medicines Using an In Vitro Detection System
Verification of Estrogen Like Activities of Herbal Medicines Using an In Vitro Detection System
Journal of Physiology & Pathology in Korean Medicine. 2013. Dec, 27(6): 752-758
Copyright © 2013, The Korean Association of Oriental Medical Physiology
  • Received : November 19, 2013
  • Accepted : December 23, 2013
  • Published : December 25, 2013
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성환 박
명제 전
민경 장
솔지 이
보경 김
명정 전
서연 김
미향 김
동근 이
태호 이
재섭 남
지원 허
상현 이
slee@silla.ac.kr

Abstract
Estrogen like activities were evaluated using ethanol and hot water extracts of herbal medicines by using an in vitro detection system. Bokryung ( Poria cocos ), Sanyak (root of Dioscorea batatas ) and Mokdanpi (root skin of Paeonia suffruticosa ) represented statistically significant estrogen-like activities (p<0.001), while Omija (fruit of Schizandra chinensis ), Taeksa (root of Alisma canaliculatum A. BR.), Jihwang (root of Rhemannia glutinosa ), and Sansuyu (fruit of Cornus officinalis ) did not. Estrogen-like activities of Bokryung hot water extract (500 μg/ml) and ethanol extract (50 μg/ml) were almost same as that of a 10 -7 M 17β-estradiol. Furthermore, estrogen-like activities of ethanol extracts (500 μg/ml) of Bokryung and Mokdanpi were stronger than that of 10 -7 M 17β-estradiol. These results suggest that Bokryung, Sanyak and Mokdanpi show estrogen-like activities. Especially, Sanyak and Mokdanpi represented promotive effect on the proliferation of MC3T3-E1 osteoblastic cells. Bokryung, Sanyak and Mokdanpi also exhibited superior inhibitory effect on the viability of RAW 264.7 cells. In conclusion, these three herbal medicines might be interpreted as candidates for the further study or development of functional foods or medicine to prevent or avoid postmenopausal symptoms of women.
Keywords
서 론
최근 우리나라는 경제활동을 하는 여성이 약 1060만 명에 달하며, 가계가 소비하는 품목들의 80% 이상을 여성이 선택할 정도로 여성의 사회 참여율 및 지위 등이 급상승하고 있는 추세이다 1) . 아울러 오늘날 여성들은 의료기술의 발달로 수명이 연장되어 일생의 후반 삼분의 일 가량을 폐경의 상태로 보내게 된다. 이러한 갱년기 여성은 폐경과 함께 난소에서 생성되는 에스트로겐의 결핍으로 인한 calcitonin 기능 억제에 따른 골전환 (bone turnover) 증가 및 파골세포 (osteoclast)의 기능 활성화와 부갑상선 호르몬 (parathyroid hormone, PTH)의 감소로 인한 골 재흡수 (bone resorption)의 증가로 골 손실을 급속하게 유발하고 이로 인하여 골 형성능력을 감소시켜 골다공증을 불러일으킬 뿐만 아니라 심혈관계 질환을 포함한 약 300여 가지의 신체적 기능 이상 및 증상이 나타난다고 보고되고 있다 2 - 4) . 이와 같은 현상에 대하여 과거에는 단지 노화로 인하여 발생하는 증상으로 치부하였으나, 현대에는 경제의 발전과 의학의 발달로 에스트로겐의 생성이 감소된 여성에 인위적으로 에스트로겐을 투여함으로써 폐경기 증상을 완화시켜 여성의 삶의 질을 개선하고 건강한 삶을 누릴 수 있게 되었다 2 , 5) . 하지만 갱년기 장애 여성의 치료에 사용되는 합성물질을 이용한 약물요법이 체중증가, 불규칙한 자궁출혈, 자궁내막암 및 유방암 등과 같은 여러 가지 형태의 부작용을 유발한다는 보고가 있다. 이러한 이유로 부작용이 적은 한약재 및 약용식물을 이용한 치료제 및 식품개발에 관심이 높아지고 있으며 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다 3 , 5 , 6) .
오랜 기간 동안에 많은 임상적인 경험을 통해 우수한 약재만을 선별하여 한약재로 사용하고 있으며, 근래에는 다양한 생리활성검색을 통해 신규물질개발 등을 위한 자원으로서 한약재의 가치가 높게 평가되고 있다. 이에 따라 천연물을 기원으로 하는 한약재를 이용하여 다양한 기능성식품이 개발되고 있어, 많은 한약재들이 한약제제로서의 역할 뿐만 아니라 건강기능성 식품의 재료로 쓰이고 있다 7) . 특히 건강기능성 식품의 소재로 활용되고 있는 일부 한약재의 추출물 중에는 에스트로겐 호르몬의 활성형태인 estradiol과 구조적, 기능적으로 유사한 식물성분으로 diphenolic structure를 공통으로 갖는 식물 유래의 화합물인 phytoestrogen을 포함하고 있어 표적장소에 따라 에스트로겐 효과와 항에스트로겐 효과를 나타낸다 8) . 폐경기 이후 여성들에게 나타나는 에스트로겐 분비 감소로 인한 갱년기 장애를 합성 에스트로겐 치료에서 나타나는 부작용 없이 완화시킬 수 있는 phytoestrogen의 임상적인 효과를 확인하고 이를 갱년기 장애의 예방 및 치료에 이용하고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다 9 - 12) .
일반적으로 생물체내로 유입된 에스트로겐 유사물질은 에스트로겐을 모방하여 세포 내에 있는 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor: ER)와 결합하여 DNA의 특정 염기서열인 estrogen responsive element (ERE)를 인식하여 결합한다. 이러한 DNA 상의 반응인자와 단백질의 결합은 그 반응인자에 의해 조절되는 유전자의 전사를 증대시켜 결국 특정 단백질의 발현을 유도하여 에스트로겐 유사물질에 의한 세포반응을 유도하는 것으로 알려져 있다 13) .
리포터(reporter) 유전자 측정법은 측정하기 어려운 단백질 등의 유전자발현을 파악하기 위하여 검출이 쉬운 단백질을 리포터로 사용하여 파악하는 방법으로 이 14) 는 CAT (chloramphenicol acetyltransferase) 유전자를 이용한 리포터 유전자 측정법으로 한약재인 길경, 황기, 감초의 에스트로겐 유사활성을 검증하였다. 이 방법은 많은 양의 시료를 처리할 수 있고 비전통적인 에스트로겐의 작용도 검출할 수 있는 장점을 가지고 있다.
한의학적으로 여성의 갱년기 장애를 다스리는 처방제로는 육미환(六味丸) 및 인삼양영탕(人蔘養營湯) 등이 있으며 15 , 16) , 육미환은 혈허와 음허(陰虛)가 동반되거나 신허로 나타나는 허로(虛老) 증상에 사용되는 보혈 강장약이며 갱년기 이후의 보약으로 많이 쓰이고 있으며, 이는 건지황, 산수유, 산약, 택사, 복령, 목단피 등이 구성되어 있다. 인삼양영탕은 극도의 피로와 허약으로 기(氣)와 혈(血)이 부족한 증상에 사용되는 허로를 다스리는 대표적인 보약으로 갱년기 증후군을 위한 대표적인 처방약이며, 이는 백작약, 당귀, 인삼, 백출, 황기, 육계, 진피, 자감초, 숙지황, 오미자, 방풍, 원지, 생강, 대추 등으로 구성되어 있다.
본 연구에서는 동의보감(東醫寶鑑) 15) 에서 여성의 갱년기 장애를 다스리는 처방제로 쓰인 육미환 혹은 인삼양영탕에 사용되고 있는 대표적인 한약재인 오미자 (Omija, fruit of Schizandra chinensis ), 택사 (Taeksa, root of Alisma canaliculatum A. BR.), 지황 (Jihwang, root of Rhemannia glutinosa ), 산약 (Sanyak, root of Dioscorea batatas ), 산수유 (Sansuyu, fruit of Cornus officinalis ), 복령 (Bokryung, Poria cocos ), 목단피 (Mokdanpi, root skin of Paeonia suffruticosa ) 등 7종의 한약재를 대상으로 하여 에스트로겐 유사활성의 검증과 갱년기 장애 시에 나타날 수 있는 골 손실 개선효과에 대한 연구를 통해 이들 한약재 추출물의 에스트로겐 대체성분으로서의 활용가능성을 탐색함과 동시에 치료제 개발의 선도물질을 탐색하기 위한 연구를 수행하였다.
재료 및 방법
- 1. 재료
- 1) 한약재
본 실험에 사용한 한약재 시료들은 오미자 (Omija, fruit of Schizandra chinensis ), 택사 (Taeksa, root of Alisma canaliculatum A. BR.), 지황 (Jihwang, root of Rhemannia glutinosa ), 산약 (Sanyak, root of Dioscorea batatas ), 산수유 (Sansuyu, fruit of Cornus officinalis ), 복령 (Bokryung, Poria cocos ), 목단피 (Mokdanpi, root skin of Paeonia suffruticosa )였다. 시료들을 ㈜휴먼허브 (Andong, Korea)에서 판매하는 것을 제공받아 사용하였으며, 한약재를 분쇄기 (HR-2094, Philips, Netherlands)로 분쇄한 다음 밀봉하여 보관하면서 사용하였다.
- 2) 세포
에스트로겐 유사물질 검정은 본 연구진에 의해 제작된 MCF7/pDsCAT-ERE119-Ad2MLP 세포 17) 를 사용하여 수행하였다. MCF7/pDsCAT-ERE119-Ad2MLP는 에스트로겐 수용체를 발현하는 인체 유방암 세포주에 에스트로겐에 반응성을 나타내도록 고안된 CAT (chloramphenicol acetyltransferase) 리포터 플라스미드를 stable transfection으로 도입한 세포주이다 14 , 17) . 생쥐 두개관 골아세포 (mouse calvaria osteoblastic cell)인 MC3T3-E1 세포주와 파골세포로의 분화를 위한 RAW 264.7 세포주는 한국 세포주은행 (Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다.
- 2. 방법
- 1) 추출물 제조
각 한약재 시료의 건조분말시료에 각각 10배량 (w/v)의 70% 에탄올 혹은 3차 증류수를 첨가한 후, 80℃에서 6시간 동안 추출을 수행하였으며, 추출액을 지름 150 mm의 여과지 (Advantec, Japan)를 이용하여 2회 여과한 후, rotary vacuum evaporator (R-200, Buchi, Switzerland)로 농축을 하였고, 농축된 추출액을 동결건조장치 (FD8518, Ilshin BioBase, Korea)를 이용하여 동결건조하여 추출물을 얻었다. 동결 건조한 추출물 100 mg을 70% 에탄올 혹은 3차 증류수 1 ml에 용해한 후, 필터 (pore size 0.20 μm filter)를 통과시켜 멸균하여 사용하였다.
Table 1 은 각 한약재를 열수 혹은 에탄올로 추출한 후 건조 중량에 대한 추출고형분의 수율을 비교 검토한 결과이다. 에탄올 추출물의 경우 9.2~29.3%의 수율을 나타냈으며, 열수 추출물의 경우 9.9~36.8%의 수율을 나타내었다.
Yields (%) of ethanol or hot water extracts of herbal medicines
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Yields (%) of ethanol or hot water extracts of herbal medicines
- 2) 세포배양
에스트로겐 유사물질 검정용 세포주 MCF7/pDsCATERE119-Ad2MLP 세포 17) 는 fetal bovine serum (FBS)에 포함되어 있는 스테로이드 호르몬을 제거하기 위하여 Dextran-coated charcoal (Sigma, USA)로 미리 처리한 10% Charcoal stripped FBS (CSF) 18) 를 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, BioWhittaker, USA) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO 2 배양기에서 배양하였다. MC3T3-E1 세포는 10% FBS (BioWhittaker)를 포함하는 α-minimal essential medium (α-MEM) (BioWhittaker) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO 2 배양기에서 배양하였고, RAW 264.7 세포는 10% FBS (BioWhittaker)와 DMEM (BioWhittaker) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO 2 배양기에서 배양하였다.
- 3) 에스트로겐 유사활성 측정
배양된 에스트로겐 유사물질 검정용 MCF7/pDsCATERE119-Ad2MLP 세포가 약 90%의 세포밀도 (confluence)가 되었을 때 1X phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 후, 새로운 DMEM (10% CSF) 배지로 교환하였다. 여기에 100% 에탄올에 녹인 에탄올 추출물 (E)과 3차 증류수에 녹인 열수 추출물(H)을 최종농도 500, 50, 5 μg/ml가 되도록 첨가하였고, 표준물질로 대표적인 에스트로겐 유사물질인 17β-estradiol (RBI, Natick, MA, USA)을 100% 에탄올에 녹여 최종농도 10 -7 M이 되도록 처리하였으며, 음성 대조군으로 추출물대신 ethanol 만을 처리하였다. 그 후, 37℃, 5% CO 2 배양기에서 48시간동안 배양한 다음 세포를 회수하였고, 1X PBS로 2회 세정한 후, 3000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 이후 1X lysis buffer 250 μl를 첨가하여 세포를 현탁하고 실온에서 30분간 방치한 후, CAT-ELISA Kit (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)를 사용하여 각 세포추출물에 포함된 Chloramphenicol acetyltransferase (CAT) 단백질의 함량을 측정하였다. CAT 단백질의 함량측정 결과는 BCA protein assay reagent kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용해 측정한 각 추출물의 총 단백질 함량으로 표준화시켰다.
- 4) 조골세포 및 파골세포의 증식에 미치는 영향
생쥐 두개관 골아세포인 MC3T3-E1세포를 조골세포로 분화 유도하기 위하여 배지에 5 mM β-glycerol phosphate (Sigma, USA)와 50 mg/ml의 vitamin C (Sigma, USA)를 첨가하여 배양하였고 19 , 20) , RAW 264.7 세포를 파골세포로 분화유도하기 위하여 배지에 30 μg/ml의 Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL, Sigma, USA)을 첨가하여 5일 동안 배양하였다 21) .
추출물의 조골세포에 대한 증식유도 활성 및 파골세포에 대한 증식억제 활성은 MTT assay 방법을 사용하여 측정하였다. 세포를 0.4% trypan blue 염색법을 이용하여 세포농도를 2×10 3 cells/ml로 조정하여 96 well plate에 접종한 후, 70% 에탄올에 녹인 에탄올 추출물 (E)과 3차 증류수에 녹인 열수 추출물 (H)을 20 μ l 씩 첨가하고 (최종농도 1, 10, 50, 100, 200, 500 μg/ml), 37℃, 5% CO 2 배양기에서 48시간 배양하였다. 이때, 음성 대조군으로 추출물대신 각각의 용매 20 μl를 첨가하여 동일하게 배양하였다. 배양 후 MTT 시약을 5 mg/ml 농도로 각각의 well에 첨가하고 37℃, 5% CO 2 배양기에서 4시간 추가 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma, USA)를 100 μl 씩 첨가하여 생성된 불용성의 formazan 결정을 용해시킨 뒤 Plate reader (AT/Infinite M200, Tecan)로 550 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 증식률은 한약재 추출물 처리군의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다 22 , 23) .
- 5) 통계처리
연구결과로 얻어진 자료는 Macintosh용 통계프로그램인 Aabel 2.0 (Gigawiz Ltd Co., USA)을 이용하여 하위그룹 각각의 기술 통계치 (Mean±SEM)를 산출하였다. 분산분석 (ANOVA) 후 Fisher's PLSD의 다중범위 유의성 검증을 실시하였고, p<0.001 수준에서 유의성을 검증하였다.
결 과
- 1. 한약재 추출물의 에스트로겐 유사활성
에스트로겐 수용체를 발현하는 것으로 알려진 인체 유방암 세포주 MCF7에 에스트로겐에 반응성을 나타내도록 고안된 CAT 리포터 플라스미드인 pDsCAT-ERE119-Ad2MLP를 도입한 in vitro 검출시스템 17) 을 사용하여 에스트로겐 유사활성을 측정한 결과를 Fig. 1 에 나타내었다.
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Estrogen like activities of hot water or ethanol extracts of herbal medicines at the 500 μg/ml concentration. MCF7/pDsCAT-ERE119-Ad2MLP cells were treated by extracts of herbal medicines. 17β-estradiol and ethanol was used as positive and negative control, respectively. H and E in back of each herbal medicine name represent hot water extract and ethanol extract, respectively. CAT protein was measured using the CAT-ELISA kit and normalized to protein concentration of cell lysates. Mean±SEM for three plates are shown as fold compared with ethanol treatment. *ANOVA p<0.001 was compared with ethanol treatment. This experiment was repeated at least twice yielding reproducible results.
오미자, 택사, 지황, 산약, 산수유, 복령, 목단피 중에서 통계적으로 유의한 에스트로겐 유사활성을 보인 것은 복령, 산약, 목단피로 나타났고 (p<0.001), 추출용매의 종류에 따라 조금씩 차이를 보였다.
한약재 추출물 중, 500 μg/ml의 농도에서 음성대조군보다 통계적으로 유의한 에스트로겐 유사활성의 증가를 나타낸 것은 복령의 에탄올 추출물 (3.0배), 복령의 열수 추출물 (2.3배), 산약의 에탄올 추출물 (2.0배), 목단피의 에탄올 추출물 (2.8배)이었다. 특히, 목단피 에탄올 추출물 (500 μg/ml)은 약 1.8배, 복령 에탄올 추출물 (500 μg/ml)은 1.9배로 양성 대조군인 10 -7 M 17β-estradiol보다 더 높은 활성을 나타내었다. 이후 복령, 산약 및 목단피 추출물에 대해 농도별로 에스트로겐 유사활성을 측정하였다.
- 2. 선정된 한약재 추출물의 농도별 에스트로겐 유사활성
Fig. 1 에서 높은 에스트로겐 유사활성을 보인 복령, 산약 및 목단피 추출물에 대해 농도별로 에스트로겐 유사활성을 측정한 결과를 Fig. 2 에 나타내었다.
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Estrogen like activities of hot water or ethanol extracts of selected herbal medicines under various concentrations. MCF7/pDsCAT-ERE119-Ad2MLP cells were treated by extracts of herbal medicines. 17β-estradiol and ethanol was used as positive and negative control, respectively. H and E in front of number represent hot water extract and ethanol extract, respectively. CAT protein was measured using the CAT-ELISA kit and normalized to protein concentration of cell lysates. Mean±SEM for three plates are shown as fold compared with ethanol treatment. *ANOVA p<0.001 was compared with ethanol treatment. This experiment was repeated at least twice yielding reproducible results.
복령 에탄올 추출물 (500, 50, 5 μg/ml), 복령 열수 추출물 (500, 50 μg/ml), 산약 에탄올 추출물 (500 μg/ml) 및 목단피 에탄올 추출물 (500 μg/ml)에서 음성대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 에스트로겐 유사활성을 보였다. 에탄올만 처리한 음성대조군과 비교한 결과, 목단피 및 복령 에탄올 추출물은 500 μg/ml의 농도에서 약 2.8배, 복령 에탄올 추출물은 50 μg/ml에서 약 2.1배, 5 μg/ml에서 1.8배의 활성을 보였다. 또한, 음성대조군 대비 복령 열수 추출물은 500 μg/ml의 농도에서 약 2.3배, 산약 에탄올 추출물은 500 μg/ml의 농도에서 2배의 에스트로겐 유사 활성을 보였다. 특히, 양성대조군인 10 -7 M 17β-estradiol의 활성과 비교한 결과, 복령 열수 추출물 (500 μg/ml)은 약 1.3배, 복령 에탄올 추출물 (500 μg/ml)은 약 1.9배, 복령 에탄올 추출물 (50 μg/ml)은 1.1배, 목단피 에탄올 추출물 (500 μg/ml) 약 1.7배 높은 통계적으로 유의한 활성을 보였다.
In vitro 검출 시스템을 이용하여 육미환과 인삼양영탕에 사용되고 있는 한약재들의 에스트로겐 유사활성을 검증한 결과, 목단피 에탄올 추출물과 산약 에탄올 추출물은 500 μg/ml의 높은 농도에서만 음성대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 에스트로겐 유사활성을 나타낸 반면, 복령 열수 추출물 및 에탄올 추출물은 50, 500 μg/ml의 농도 모두에서 음성대조군과 비교하여 에스트로겐 유사활성이 확인되었다. 따라서, 목단피, 산약 및 특히 복령은 갱년기 장애를 예방하고 개선할 수 있는 기능성 식품이나 의약품 개발을 위한 소재로 활용이 가능할 것으로 기대된다.
- 3. 한약재 추출물이 조골세포의 증식에 미치는 영향
정상인은 조골세포에 의한 골 형성과 파골세포에 의한 골재흡수로 이루어진 골 재형성이 균형을 이루지만 조골세포의 기능이 저하되거나 파골세포의 기능이 증가하면 골 재흡수가 증가되어 골밀도가 저하되고 골다공증으로 이어지게 되며, 골 재형성에 에스트로겐이 관여하는 것으로 알려져 있다 24) . 또한, 골 재형성에 있어 조골세포의 골 형성 활성도 중요하지만 조골세포 자체의 증식도 중요한 역할을 담당할 것이다. 이에 에스트로겐 활성이 확인된 한약재 추출물들의 농도에 따른 조골세포의 증식에 미치는 영향을 MTT assay로 분석하였고, 그 결과를 Fig. 3 에 나타내었다. 복령 에탄올 추출물은 전반적으로 조골세포의 증식을 억제하였다. 산약 열수 추출물은 비교적 낮은 농도인 10 μ g/ml의 농도에서 증식률이 119.4%로 최대의 증식률을 나타내었고, 그외의 농도에서는 증식촉진 효과가 관찰되지 않았다. 산약 에탄올 추출물 50, 100 μ g/ml의 농도에서는 통계적으로 유의한 증식억제 효과가 관찰되었다. 목단피 열수 추출물 및 에탄올 추출물은 100 μ g/ml까지의 농도에서는 증식률을 증가시켰으나, 500 μ g/ml의 고농도로 첨가하였을 때에는 대조군보다 세포증식률을 감소시키는 경향을 나타내었다 (p<0.001). 농도가 낮은 경우에는 목단피 에탄올 추출물이 열수 추출물에 비해 더 높은 증식률을 나타냈으나, 100 μ g/ml 이상의 농도에서는 열수 추출물이 124.5%로 더 높은 증식률을 보였다. 따라서 조골세포에 대해 증식 효과를 높게 나타내는 한약재는 목단피 및 산약 추출물인 것으로 확인되었다.
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Effects of hot water or ethanol extracts of herbal medicines on the proliferation of MC3T3-E1 osteoblastic cells. MC3T3-E1 cells were treated various concentrations of hot water (H) and ethanol (E) extracts of (A) Bokryung (Poria cocos), (B) Sanyak (root of Dioscorea batatas), and (C) Mokdanpi (root of Paeonia suffruticosa). Mean±SEM for three wells are shown as cell viability (%) compared with control (no treatment as 100%). *ANOVA p<0.001 was compared with control. This experiment was repeated at least twice yielding reproducible results.
임 등은 여러 한약재 중에서 두충, 곽향, 개다래, 형개, 정공 등의 추출물이 조골세포 증식 및 ALP (alkaline phosphatase) 활성을 증가시켰으며, 파골세포 활성을 나타내는 TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) 활성을 억제하는 것으로 보고하였다 25) . 임 등의 연구재료와 본 연구의 재료 사이에 공통점은 없지만 본 연구에서 나타난 조골세포의 증식효과는 골의 파괴를 방지하는데 직간접적으로 기여할 가능성이 높다고 할 것이다 25) . 서 등은 감초 에탄올 추출물이 조골세포의 분화를 촉진한다고 보고하였다 26) . 본 연구에서는 목단피의 우수한 조골세포 증식능과 복령, 산약의 조골세포 증식 가능성 확인을 통해 이들 한약재들의 우수한 조골 관련 활성을 확인할 수 있었다( Fig. 3 ).
- 4. 한약재 추출물이 파골세포의 증식억제에 미치는 영향
골다공증은 에스트로겐 결핍이 파골세포의 증식 및 활성을 증가시켜 골 재흡수를 촉진하기 때문으로 보고되고 있다 27 , 28) . 이에 본 연구에서는 에스트로겐 활성이 확인된 한약재 추출물의 농도에 따른 파골세포의 증식에 미치는 영향을 MTT assay로 분석하였고, 그 결과를 Fig. 4 에 나타내었다. 복령 에탄올 추출물은 전반적으로 파골세포의 증식을 억제하는 것으로 나타났다. 산약 열수 추출물은 농도 의존적으로 세포의 증식을 억제하였으나, 에탄올 추출물에 비해 억제율이 낮게 나타났고, 1, 10 μ g/ml의 농도에서는 오히려 파골세포의 증식을 촉진하였다. 목단피 열수 추출물과 에탄올 추출물 모두에서 파골세포 증식억제 효과가 확인되었으며 (p<0.001), 목단피 열수 추출물은 에탄올 추출물보다 파골세포의 증식억제 효과가 높게 나타났다. 파골세포의 증식억제는 목단피 추출물에서 가장 높게 나타났으며, 복령 추출물 역시 높게 나타났다. 따라서, 에스트로겐 결핍 등의 영향으로 골 형성이 어려운 조건에서 골의 파괴를 억제하는 소재로서 목단피, 산약 및 복령 추출물이 적합한 것으로 확인되었다.
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Effects of hot water or ethanol extracts of herbal medicines on the viability of RAW 264.7 osteoclastic cells. MC3T3-E1 cells were treated various concentrations of hot water (H) and ethanol (E) extracts of (A) Bokryung (Poria cocos), (B) Sanyak (root of Dioscorea batatas), and (C) Mokdanpi (root of Paeonia suffruticosa). Mean±SEM for three wells are shown as cell viability (%) compared with control (no treatment as 100%). *ANOVA p<0.001 was compared with control. This experiment was repeated at least twice yielding reproducible results.
임 등은 개다래, 두충, 형개, 곽향, 정공 추출물의 경우에 조골세포의 증식과 함께 세포독성 없이 파골세포의 활성을 억제하는 우수한 소재임을 보고하였다 25) . 본 연구에서는 목단피와 복령 추출물이 동일한 농도에서 조골세포의 증식은 촉진하고 파골세포의 증식을 억제하여 단순한 세포독성에 의한 파골세포의 증식억제는 아닐 가능성이 높은 것으로 판단되었으므로, 복령과 목단피 등의 한약재를 이용하여 골다공증의 예방과 증상 완화에 도움을 주는 소재의 개발이 가능할 것으로 판단된다.
- 5. 한약재의 여성갱년기 장애 개선을 위한 소재로의 개발 가능성
생약·한약제제의 임상시험계획서는 2005년에 7건이었으나, 2009년에는 44건으로 해마다 지속적으로 증가하여 전통 한방의 우수성이 과학적으로 입증되고 있으며 29) 여러 제약회사에서 한방에 근거한 다양한 의약품을 생산하고 있다. 한약재를 이용한 치료제인 천연물신약 개발을 위한 연구로 골관절염 치료제 30) , 당뇨합병증-비만치료제 31) 등이 알려져 있다. 본 연구를 통해 동의보감에서 여성의 갱년기 장애를 다스리는 처방제로 쓰인 육미환 및 인삼양영탕에 들어있는 대표적인 7가지 한약재들 중에서 통계적으로 유의한 에스트로겐 유사활성을 나타내는 한약재는 복령, 산약 및 목단피였고, 조골세포의 증식을 촉진하고 파골세포의 증식을 억제하여 골유지 활성이 높은 한약재는 목단피와 복령이었다. 따라서 이들 한약재들은 향후 추가적인 연구를 통하여 갱년기장애 개선을 위한 소재의 개발에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단되었다.
결 론
In vitro 검증 시스템을 이용하여 한약재의 에탄올 및 열수 추출물들의 에스트로겐 유사활성을 검증하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 첫째, 복령 (Bokryung, Poria cocos ), 산약 (Sanyak, root of Dioscorea batatas ) 및 목단피 (Mokdanpi, root skin of Paeonia suffruticosa )는 통계적으로 유의한 에스트로겐 유사활성을 보인 반면, 오미자 (Omija, fruit of Schizandra chinensis ), 택사 (Taeksa, root of Alisma canaliculatum A. BR.), 지황 (Jihwang, root of Rhemannia glutinosa ) 및 산수유 (Sansuyu, fruit of Cornus officinalis )는 활성을 나타내지 않았다. 둘째, 복령 열수 추출물 (500 μg/ml)과 산약 에탄올 추출물 (500 μg/ml) 및 에탄올 추출물 (50 μg/ml)의 활성은 표준물질인 17β-estradiol의 10 -7 M 에서의 활성과 거의 유사하였다. 또한, 복령과 목단피의 에탄올 추출물들 (500 μg/ml)의 활성은 10 -7 M 17β-estradiol의 활성보다 약 1.5배 더 높은 활성을 보였다. 따라서 복령, 산약 및 목단피 추출물은 에스트로겐 유사활성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 특히, 산약 및 목단피 추출물은 조골세포의 증식 촉진 효과를 나타내었고, 복령, 산약 및 목단피 추출물은 파골세포의 증식억제 효과를 나타내었다. 결론적으로, 이들 세 종류의 한약재는 여성의 갱년기 장애의 예방 및 개선을 위한 기능성 식품 및 의약품의 개발에 활용이 가능할 것으로 기대된다.
References
강 성림 , 김 미향 2009 생명과학회지 19 1841 - 1846
김 동진 2003 대한지역사회영양학회지 8 1030 - 1033
박 용수 , 강 민숙 , 김 보경 , 김 미향 2013 한국식품영양과학회지 42 33 - 39
황 귀서 , 이 대영 2003 대한예방한의학회 7 55 - 66
Bae I.Y. , Lee J.Y. , Kwak B.Y. , Lee H.G. 2011 Estrogenic effects of various extracts from Chamdanggui (Angelicagigas Nakai) and Sogdan (Phlomis umbrosa Turcz). Food Sci and Biotechnol 20 1113 - 1118    DOI : 10.1007/s10068-011-0151-1
윤 지혜 , 황 은선 , 김 건희 2011 한국식품영양과학회지 4 1384 - 1390
이 화동 , 석사학위논문 2009 대구한의대학교 석사학위논문
이 창민 , 강 세찬 , 오 좌섭 , 최 한 , 이 설매 , 이 재현 , 이 미현 , 정 의수 , 곽 종환 , 지 옥표 2006 생약학회지 37 21 - 27
양 세란 , 홍 희도 , 조 성대 , 안 남식 , 정 지원 , 박 준석 , 조 은혜 , 황 재웅 , 순 보 , 박 정란 , 이 성훈 , 정 지윤 , 최 창순 , 강 경선 , 이 영순 2005 한국식품위생안전성학회지 20 1 - 6
Lee S.W. , Jang M.K. , Kim N.Y. , Jang H.J. , Lee D.G. , Kim M.H. , Kim Y.Y. , Kim S.G. , Yoo B.H. , Lee S.H. 2010 Verification of the fractions with strong estrogenic activities from brown algae. J Life Sci 20 1807 - 1811    DOI : 10.5352/JLS.2010.20.12.1807
김 성란 , 최 선영 , 안 지윤 , 하 태열 2003 한국작물학회지 48 31 - 40
이 동근 , 이 상현 2007 동의생리병리학회지 21 153 - 157
김 재수 , 박 준홍 , 조 한성 , 박 점석 , 홍 억기 2002 한국생물공학회지 17 409 - 415
이 상현 2003 동의생리병리학회지 17 1054 - 1058
허 준 2007 법인문화사
http://blog.daum.net/leemsaan/13738320
Jang M.K. , Lee O.H. , Kim M.H. , Lee Y.A. , Kang S.R. , Lee S.H. 2008 Evaluation of the estrogenic activities of natural products. J Clin Biochem Nutr 43 145 - 148
Ponglikitmongkol M. , White J.H. , Chambon P. 1990 Synergistic activation of transcription by the human estrogen receptor bound to tandem responsive elements. EMBO J 9 2221 - 2231
Choi E.M. , Suh K.S. , Kim Y.S. , Choue R.W. , Koo S.J. 2001 Soybean ethanol extract increase the function of osteoblastic MC3T3-E1 cells. Phytochemistry 56 733 - 39    DOI : 10.1016/S0031-9422(00)00484-2
Yan Z. , Bing Z. , Zhenyu S. , Qiong W. , Guo-Qiang C. 2007 The effect of 3-hydroxybutyrate on the in vitro differentiation of murine osteoblast MC3T3-E1 and in vivo bone formation in ovariectomized rats. Biomaterials 28 3063 - 3073    DOI : 10.1016/j.biomaterials.2007.03.003
Shevde N.K. , Bendixen A.C. , Dienger K.M. , Pike J.W. 2000 Estrogens suppress RANK ligand-induced osteoclast differentiation via a stromal cell independent mechanism involving c-Jun repression. Proc Natl Acad Sci 97 7829 - 7834    DOI : 10.1073/pnas.130200197
Garett I.R. , Boyce B.F. , Oreffo R.O. , Bonewald L. , Poser J. , Mundy G.R. 1990 Oxygen-derived free radicals stimulate osteoclastic bone resorption in rodent bone in vitro and in vivo. J Clin Invest 85 632 - 639    DOI : 10.1172/JCI114485
Green L.M. , Reade J.L. , Ware C.F. 1984 Rapid colometric assay for cell viability: Application to the quantitation of cytotoxic and growth inhibitory lymphokines. J Immunol Methods 70 257 - 268    DOI : 10.1016/0022-1759(84)90190-X
Spelsberg T.C. , Subramaniam M. , Riggs B.L. , Khosla S. 1999 The actions and interactions of sex steroids and growth factors/ cytokines on the skeleton. J Mol Endocrinol 13 819 - 828    DOI : 10.1210/mend.13.6.0299
임 남경 , 김 현정 , 김 미진 , 이 은주 , 김 혁일 , 이 인선 2010 한국식품과학회지 42 637 - 642
서 초롱 , 변 종선 , 안 재진 , 이 재환 , 홍 정우 , 장 상호 , 박 계원 2013 한국식품영양과학회지 42 1015 - 1021
Jilka R.L. 1998 Cytokines, bone remodeling and estrogen deficiency. Bone 23 75 - 81    DOI : 10.1016/S8756-3282(98)00077-5
Boyle W.J. , Simonet W.S. , Lacey D.L. 2003 Osteoclast differentiation and activation. Nature 423 337 - 342    DOI : 10.1038/nature01658
허가심사조정과 2010 식품의약품안전청 34 - 37
http://www.asiae.co.kr/news/view.htm?idxno=2009031613351435350&nvr=y
http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=kiompr&logNo=90124183063