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Effect of White Ginseng-Ejung-tang Water Extract on Cytokine Production in LPS-induced RAW 264.7 Mouse Macrophages
Effect of White Ginseng-Ejung-tang Water Extract on Cytokine Production in LPS-induced RAW 264.7 Mouse Macrophages
Journal of Physiology & Pathology in Korean Medicine. 2013. Dec, 27(6): 738-744
Copyright © 2013, The Korean Association of Oriental Medical Physiology
  • Received : August 26, 2013
  • Accepted : November 18, 2013
  • Published : December 25, 2013
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완수 박
hangl98@naver.com

Abstract
The purpose of this study is to investigate effects of White Ginseng-Ejung-tang water extract (EJ) on production of various cytokines such as interleukin (IL)-2, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, macrophage inflammatory protein (MIP)-2, vascular endothelial growth factor (VEGF), keratinocyte-derived chemokine(KC), tumor necrosis factor (TNF)-α, and granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) in RAW 264.7 mouse macrophages stimulated by lipopolysaccharide (LPS). Levels of cytokines were measured by High-throughput multiplex bead array cytokine assay based on xMAP (multi-analyte profiling beads) technology. EJ significantly decreased levels of IL-2, IL-12p70, IL-5, MIP-2 for 24 h incubation at the concentrations of 25, 50, and 100 ㎍/mL in LPS-induced RAW 264.7 (P < 0.05). EJ significantly decreased levels of IL-6 at the concentrations of 50 and 100 ㎍/m (P < 0.05). EJ significantly decreased levels of IL-10 and VEGF at the concentrations of 25 and 100 ㎍/mL (P < 0.05). EJ significantly decreased levels of KC at the concentrations of 100 ㎍/mL (P < 0.05). EJ did not show any significant effect on TNF-α and GM-CSF production. These results suggest that EJ has anti-inflammtory property related with its inhibition of IL-2, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, MIP-2, VEGF, and KC production in LPS-induced macrophages.
Keywords
서 론
이중탕(理中湯)은 인삼(人蔘), 백출(白朮), 건강(乾薑), 자감초(炙甘草)로 구성되는 한약(韓藥)으로 한대(漢代) 장중경(張仲景)의 상한론(傷寒論) 1) 에 처음 ‘이중환(理中丸)’으로 제시되고 속이 차서 생기는 소화불량(消化不良), 구역(嘔逆), 구토(嘔吐), 설사(泄瀉), 복창(腹脹), 복만(腹滿), 복통(腹痛) 등의 위장관질환(寒冷性胃腸疾患)에 널리 응용되는 것으로 알려져 있다. 2 - 5)
대식세포 혹은 탐식세포라 불리우는 마크로파지(macrophage)는 인체면역염증반응을 담당하는 주요한 세포중의 하나로서 외부로부터 침입하는 다양한 병원체에 반응하여 cytokine, nitric oxide(일산화질소; NO), hydrogen peroxide(하이드로겐 퍼록사이드) 등 다양한 면역염증매개물질들을 생성, 배출한다. 5 - 8) 즉, 외부로부터 침입하는 병원체성 항원(pathogenic antigen)에 자극된 대식세포는 interleukin(IL), tumor necrosis factor(TNF)-α와 같은 싸이토카인(cytokine) 뿐만 아니라 interferon-inducible protein(IP), keratinocyte-derived chemokine(KC), macrophage inflammatory protein(MIP), monocyte chemoattractant protein (MCP)과 같은 케모카인(chemokine), vascular endothelial growth factor(VEGF), macrophage-colony stimulating factor(M-CSF), granulocyte macrophage-colony stimulating factor(GM-CSF)와 같은 성장인자(growth factor)를 생성, 배출하여 면역염증반응을 일으키게 된다 9) . 그러나 지나친 면역염증매개물질의 생성은 급성 및 만성 염증질환으로 발전될 수 있기 때문에 염증반응을 제어할 수 있는 물질에 대한 연구가 근래 지속되고 있다.
최근 인삼(人蔘)을 열처리가공하여 제조한 것을 홍삼(紅蔘)이라하고, 열처리가공하지 않은 상태의 인삼은 백삼(白蔘)으로 명칭하며 인삼이 들어가는 한약처방에도 홍삼과 백삼을 구분하여 조제하고 있다 5) . 아직까지 백삼이 포함된 이중탕물추출물이 마우스 대식세포의 싸이토카인 생성에 미치는 영향에 대한 자세한 보고는 이루어진 바 없다.
본 연구에서는 백삼(白蔘)이 포함된 이중탕(理中湯)을 동결 건조하여 얻은 물추출물(EJ)이 세균성내독소(endotoxin)의 일종인 지질다당체(lipopolysaccharide; LPS)로 촉발된 마우스대식세포 RAW 264.7가 배출하는 싸이토카인 중 IL-2, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, MIP-2, VEGF, KC, TNF-α, GM-CSF 등의 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 in vitro 실험을 수행하여 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
재료 및 방법
- 1. 재료
- 1) 시약 및 기기
본 실험에 사용된 시약 중 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), heat-inactivated fetal bovine serum(FBS), penicillin and streptomycin, phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.4)은 Gibco BRL사(NY, USA)에서, multiplex cytokine assay kit는 Panomics사(CA, USA)로부터, 기타 시약은 Sigma-Aldrich사(MO, USA)로부터 구입하여 사용하였으며 각 시약의 품질은 분석용 등급 이상의 것으로 하여 사용하였고, 본 실험에 사용된 기기들은 CO 2 incubator(NUAIRE, USA), clean bench(Jeiothec, Korea), rotary vacuum evaporator(Eyela, Japan), research microscope(Becton dickinson, USA), centrifuge(Gyrozen, Korea), water bath(Sae Han, Korea), vortex mixer(Vision Scientific Co, Korea), freeze dryer(Eyela), deep freezer(Gudero, Ilshin Lab, Korea), Bio-plex 200(Bio-Rad) 등 이었다 5) .
- 2) 약재
본 실험에 사용된 약재 중 백삼(白蔘), 백출(白朮), 건강(乾薑), 감초(甘草)는 옴니허브주식회사(대구, 한국)로부터 구입한 후 검정하였으며 검정된 약재들(No. 201006-10/11/12/13)은 가천대학교 한의과대학 병리학교실에 보관되었다. 5)
- 2. 방법
- 1) 시료의 제조
시료의 제조는 이미 보고한 선행연구의 방법에 따라 다음과 같이 시행하였다. 백삼(白蔘), 백출(白朮), 건강(乾薑), 감초(甘草) 각 12.5 g을 혼합하여 얻은 백삼이중탕(白蔘理中湯) 50 g을 전기 약탕기에 1차 증류수 1,000 mL와 함께 넣은 뒤 150분 동안 가열, 추출하였다. 추출이 끝난 뒤 추출액을 filter paper(Advantec No.2, Japan)로 감압 여과한 뒤, 여과액을 rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축하였다. 이 농축액을 동결건조기를 이용하여 건조하여 백삼이중탕의 시료용 동결건조추출물(EJ)을 제조하여 실험에 사용하였다. 감초(甘草)는 추출하기 전에 열을 가하여 자감초(炙甘草)로 만든 후 사용하였다 4 , 5 , 10 , 11) .
- 2) Cell line
실험에 사용된 대식세포는 mouse macrophage(RAW 264.7 cell line)이며, 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 구입하였다.
- 3) 세포 배양
세포의 배양은 이미 보고된 선행연구의 방법에 따라 다음과 같이 시행되었다. RAW 264.7 cells은 37℃, 5% CO 2 조건에서 10% FBS, penicillin(100 U/mL), streptomycin(100 ㎍/mL)이 첨가된 DMEM 배지로 75 cm 2 flask (Falcon, USA)에서 배양되었다. 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 phosphate buffered saline(Sigma, USA) 용액으로 씻어주며 충분히 증식되면, 50 mL flask 당 1 mL의 0.25% trypsin-EDTA용액을 넣고 실온에서 1분 간 처리한 다음 trypsin용액을 버리고 37℃에서 5분간 보관후 세포를 탈착하여 계대 배양하였고, 탈착된 세포는 10% FBS가 첨가된 DMEM 배양액 10 mL에 부유시킨 다음, 새로운 배양용기에 옮겨 1 : 2의 split ratio로 CO 2 배양기(37℃, 5% CO 2 )에서 배양하였다 4 , 5 , 10 , 11) .
- 4) 멀티플렉스 싸이토카인 분석(multiplex cytokine assay)
LPS로 활성화된 RAW 264.7 cells의 각종 cytokine 생성과 관련된 시료의 영향을 알아보기 위해 선행연구의 방법을 참고하여 다음과 같이 실험을 시행하였다. 96 well plate에 1×10 4 cells/well의 농도로 분주되도록 1×10 5 cells/mL의 cell을 100 μL씩 넣고 37℃, 5% CO 2 incubator에서 24시간동안 배양한 후, 배지를 버리고 배양세포 표면을 PBS용액으로 씻어준 뒤, LPS(1 ㎍/mL) 단독 혹은 배지에 녹인 시료와 함께 각 well에 처리하고 24시간 동안 배양하였으며, 배양이 끝나면 상층액을 채취하여 다음의 멀티플렉스어세이를 실시하는 데, 세포배양 상층액을 분주하기 전에 96 well plate 타입의 Filter plate를 wash buffer로 세척 후, 특정항체가 결합되어 있는 beads를 분주한 후 다시 한번 wash buffer로 세척하고 세척이 끝나면 세척액을 모두 제거한 후 준비된 세포배양상층액과 표준물질(standard cytokine)을 각 well에 50 μL씩 분주하였으며, 분주가 끝나면 실온에서 30분간 500 rpm의 속도로 shaking하며, 30분간의 shaking incubation이 끝나면 wash buffer를 이용, 3회의 세척을 실시하였고, 세척이 끝나면 세척액을 모두 제거한 후 미리 혼합된 Detection Antibody를 각 well에 25 μL씩 분주하고 실온에서 30분간 500 rpm의 속도로 shaking한 뒤, 30분간의 shaking incubation이 끝나면 wash buffer를 이용, 3회의 세척을 실시하였으며, 세척이 끝나면 세척액을 모두 제거한 후 미리 잘 섞인 Streptavidin-PE를 각 well에 50 μL씩 분주하고 실온에서 30분간 500 rpm의 속도로 shaking하며, 30분간의 shaking incubation이 끝나면 wash buffer를 이용, 3회의 세척을 실시하고 세척이 끝나면 세척액을 모두 제거한 후 각 well에 Reading buffer를 120 μL씩 분주하고 실온에서 5분간 500rpm의 속도로 shaking한 후 Bioplex-200을 이용, 각 cytokine의 생성수준을 측정, 비교하였다. 10)
- 3. 통계처리
실험성적은 평균치 ± 표준편차 (Mean ± SD)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균 차이는 Moses-test로 분석하여 P < 0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
결 과
- 1. EJ가 LPS로 촉발된 RAW 264.7의 IL-2 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL)와 함께 EJ(0, 25, 50, 100 ㎍/mL)가 포함된 배지에 RAW 264.7 cells을 24시간 동안 배양한 결과 LPS로 인한 IL-2 생성증가를 EJ가 25, 50, 100 ㎍/mL의 모든 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰다( Fig. 1 ). 실험결과가 비록 농도의존적이지는 않았지만, 3회 이상 실험한 결과이기 때문에 의미 있는 것으로 해석되었다.
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Effect of EJ on production of IL-2 in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL) and EJ (0, 25, 50, 100 ㎍/mL) for 24 h. Results are represented as mean ± SD of more than three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. * represents P < 0.05 compared to the control.
- 2. EJ가 LPS로 촉발된 RAW 264.7의 IL-5 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL)와 함께 EJ(0, 25, 50, 100 ㎍/mL)가 포함된 배지에 RAW 264.7 cells을 24시간 동안 배양한 결과 LPS로 인한 IL-5 생성증가를 EJ가 25, 50, 100 ㎍/mL의 모든 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰다( Fig. 2 ). 실험결과가 비록 농도의존적이지는 않았지만, 3회 이상 실험한 결과이기 때문에 의미 있는 것으로 해석되었다.
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Effect of EJ on production of IL-5 in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL) and EJ (0, 25, 50, 100 ㎍/mL) for 24 h. Results are represented as mean ± SD of more than three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. * represents P < 0.05 compared to the control.
- 3. EJ가 LPS로 촉발된 RAW 264.7의 IL-12p70 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL)와 함께 EJ(0, 25, 50, 100 ㎍/mL)가 포함된 배지에 RAW 264.7 cells을 24시간 동안 배양한 결과 LPS로 인한 IL-12p70 생성증가를 EJ가 25, 50, 100 ㎍/mL의 모든 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰다( Fig. 3 ). 실험결과가 비록 농도의존적이지는 않았지만, 3회 이상 실험한 결과이기 때문에 의미 있는 것으로 해석되었다.
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Effect of EJ on production of IL-12p70 in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL) and EJ (0, 25, 50, 100 ㎍/mL) for 24 h. Results are represented as mean ± SD of more than three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. * represents P < 0.05 compared to the control.
- 4. EJ가 LPS로 촉발된 RAW 264.7의 MIP-2 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL)와 함께 EJ(0, 25, 50, 100 ㎍/mL)가 포함된 배지에 RAW 264.7 cells을 24시간 동안 배양한 결과 LPS로 인한 MIP-2 생성증가를 EJ가 25, 50, 100 ㎍/mL의 모든 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰다( Fig. 4 ). 실험결과가 비록 농도의존적이지는 않았지만, 3회 이상 실험한 결과이기 때문에 의미 있는 것으로 해석되었다.
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Effect of EJ on production of MIP-2 in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL) and EJ (0, 25, 50, 100 ㎍/mL) for 24 h. Results are represented as mean ± SD of more than three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. * represents P < 0.05 compared to the control.
- 5. EJ가 LPS로 촉발된 RAW 264.7의 IL-6 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL)와 함께 EJ(0, 25, 50, 100 ㎍/mL)가 포함된 배지에 RAW 264.7 cells을 24시간 동안 배양한 결과 LPS로 인한 IL-6 생성증가를 EJ가 50, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰다( Fig. 5 ).
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Effect of EJ on production of IL-6 in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL) and EJ (0, 25, 50, 100 ㎍/mL) for 24 h. Results are represented as mean ± SD of more than three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. * represents P < 0.05 compared to the control.
- 6. EJ가 LPS로 촉발된 RAW 264.7의 IL-10 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL)와 함께 EJ(0, 25, 50, 100 ㎍/mL)가 포함된 배지에 RAW 264.7 cells을 24시간 동안 배양한 결과 LPS로 인한 IL-10 생성증가를 EJ가 25, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰다( Fig. 6 ). 실험결과가 비록 농도의존적이지는 않았지만, 3회 이상 실험한 결과이기 때문에 의미 있는 것으로 해석되었다.
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Effect of EJ on production of IL-10 in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL) and EJ (0, 25, 50, 100 ㎍/mL) for 24 h. Results are represented as mean ± SD of more than three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. * represents P < 0.05 compared to the control.
- 7. EJ가 LPS로 촉발된 RAW 264.7의 VEGF 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL)와 함께 EJ(0, 25, 50, 100 ㎍/mL)가 포함된 배지에 RAW 264.7 cells을 24시간 동안 배양한 결과 LPS로 인한 VEGF 생성증가를 EJ가 25, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰다( Fig. 7 ). 실험결과가 비록 농도의존적이지는 않았지만, 3회 이상 실험한 결과이기 때문에 의미 있는 것으로 해석되었다.
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Effect of EJ on production of VEGF in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL) and EJ (0, 25, 50, 100 ㎍/mL) for 24 h. Results are represented as mean ± SD of more than three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. * represents P < 0.05 compared to the control.
- 8. EJ가 LPS로 촉발된 RAW 264.7의 KC 생성증가에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL)와 함께 EJ(0, 25, 50, 100 ㎍/mL)가 포함된 배지에 RAW 264.7 cells을 24시간 동안 배양한 결과 LPS로 인한 KC 생성증가를 EJ가 100 ㎍/mL의 농도에서 유의(P < 0.05)하게 감소시켰다( Fig. 8 ).
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Effect of EJ on production of KC in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL) and EJ (0, 25, 50, 100 ㎍/mL) for 24 h. Results are represented as mean ± SD of more than three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only. * represents P < 0.05 compared to the control.
- 9. EJ가 LPS로 촉발된 RAW 264.7의 TNF-α와 GM-CSF 생성에 미치는 영향
LPS(1 ㎍/mL)와 함께 EJ(0, 25, 50, 100 ㎍/mL)가 포함된 배지에 RAW 264.7 cells을 24시간 동안 배양한 결과 LPS로 인한 TNF-α와 GM-CSF 생성증가에 대해서는 EJ가 유의한 변화를 나타내지 않았다( Fig. 9 , Fig. 10 ).
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Effect of EJ on production of TNF-α in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL) and EJ (0, 25, 50, 100 ㎍/mL) for 24 h. Results are represented as mean ± SD of more than three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only.
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Effect of EJ on production of GM-CSF in LPS-induced RAW 264.7 cells. Cells were incubated with LPS (1 ㎍/mL) and EJ (0, 25, 50, 100 ㎍/mL) for 24 h. Results are represented as mean ± SD of more than three independent experiments. Normal : Normal group treated with culture medium only. Control : Control group treated with LPS only.
고 찰
비양허손(脾陽虛損)증은 한냉성 위장질환(寒冷性胃腸疾患)으로 이해될 수 있는 증(證)으로 소화기계통의 양기(陽氣)가 부족하여 나타나는 소화불량(消化不良), 구역(嘔逆), 구토(嘔吐), 설사(泄瀉), 복창(腹脹), 복만(腹滿), 복통(腹痛) 등의 증세로 구성된다 1 - 5) . 이중탕(理中湯)은 이러한 비양허손(脾陽虛損)증에 대하여 온중(溫中)하고 거한(祛寒)하여 비양(脾陽)을 회복시키고 비위(脾胃)의 운화(運化)작용을 도와주도록 보비(補脾)하고 익위(益胃)한다 1 - 5) . 즉 비위(脾胃)가 허한(虛寒)한 것과 관련되는 토사곽란(吐瀉癨亂), 소아만경병(小兒慢驚病)과 중초허한(中焦虛寒)과 관련된 흉비(胸痺) 등이 이중탕(理中湯)의 적응증이 되는 것이다 1 - 5) . 이중탕(理中湯)에 부자(附子)를 가한 부자이중환(附子理中丸)은 맥이 약하고 손발이 차며 정신을 잃어 눈을 제대로 감지 못하거나 또는 한사(寒邪)가 인체 내부에 침입하여 토사곽란(吐瀉霍亂)과 함께 몸근육의 뒤틀림, 입을 꽉 다물고 열지 않음(口噤), 팔다리에 강직이 오는 증상들, 즉 비장(脾臟)과 신장(腎臟)의 양기(陽氣)가 허한 병기와 관련된 음한중증(陰寒重證)에 적용된다고 하였다. 그 외에 배꼽위쪽으로 신기(腎氣)가 동(動)하는 경우에는 백출(白朮)을 빼고 육계(肉桂)를 추가하며, 토(吐)하는 것이 심한 경우에는 백출(白朮) 대신에 생강(生薑)을 넣어준다고 하였고, 복통(腹痛)이 심하면 목향(木香)을 추가하며, 반위구토(反胃嘔吐)가 심한 경우에는 생강(生薑)과 반하(半夏)를 더해주거나 정향(丁香), 백두구(白荳蔲)를 더해주며, 수종(水腫)에는 복령(茯苓), 택사(澤瀉), 동과피(冬瓜皮) 등을 더해준다고 하였다 1 - 5) .
면역염증반응과정중에 있어 지질다당체(LPS)와 같은 내독소(endotoxin)에 의해서 자극받은 대식세포가 만들어내는 cytokine, nitric oxide, hydrogen peroxide와 같은 다양한 형태의 면역염증매개물질들(inflammatory mediators)이 제어되지 않고 과잉된 상태(excessive state)가 지속되면 주변 정상조직의 손상 및 다양한 종류의 급 만성 염증질환으로 발전할 수가 있다 6 , 9 , 12 - 14) . 그러므로 과잉된 면역염증매개물질의 생성을 조절할 수 있는 물질에 대한 연구가 많이 수행되고 있으며 한약재 및 한약 처방을 대상으로 한 항염효능연구도 근래에 많이 이루어지고 있다. 최근 Lee 등 5) 은 LPS에 의해 유발된 RAW 264.7의 NO와 세포내 hydrogen peroxide 생성증가를 백삼이중탕물추출물이 유의하게 감소시킴에 대해서 보고한 바 있다.
LPS는 그람음성균(gram negative bacteria)의 세포벽에 위치하는 내독소(endotoxin)의 일종으로서 대식세포로 하여금 염증 촉발물질의 급격한 생성증가를 유발한다. 그러므로 LPS에 의한 과도한 염증반응을 적절히 조절할 수 있는 활성이 염증치료제개발의 중요한 검색지표로 인식되고 있다 9) .
LPS에 의해 자극된 대식세포가 과잉생성하는 cytokine으로는 IL-1α, IL-6, IL-10, IL-12와 같은 인터루킨류, TNF-α, IP-10, KC, MCP-1, MCP-3, VEGF, GM-CSF 등이 있다. 이중 IL-6과 IL-12는 다발성경화증(multiple sclerosis)이나 류마티스성 관절염(rheumatic arthritis)과 같은 자가면역질환(autoimmune disease)에서 생성이 증가되고 15) , IL-10은 크론병(Crohn’s disease)과 전신성홍반성낭창(systemic lupus erythematosus)에서 16) , MIP-2, MCP-1, M-CSF, GM-CSF 등은 폐렴에서 증가 17) 하는 것으로 알려져 있고, 자궁내막증식증(endometriosis)에서는 VEGF와 GM-CSF 등이 증가하는 것으로 알려져 있으며 18) , 퇴행성뇌질환과 같은 중추성염증질환(neurodegenerative disease)에서는 KC와 IP-10이 증가하며 19) , 천식(athma)의 경우에는 IL-1α, IL-2, IL-5, IL-9, IL-13, G-CSF, KC 등이 증가하고 20) , MCP-1은 죽상동맥경화증(atherosclerosis)에서 증가하는 것으로 알려져 있다 21) .
선행된 연구에서 한 등 22) 은 백삼이 LPS에 의해서 유도된 대식세포의 NO, TNF-α, IFN-γ 생성증가를 억제한다고 보고한 바 있으며, 최 23) 에 의해서는 백출(白朮)이, 이 등 24) 에 의해서는 건강(乾薑)이, 박 등 25) 에 의해서는 감초(甘草)가 LPS로 유도된 대식 세포의 NO를 억제하는 항염작용에 대한 보고를 한 바 있다. 또한 이중탕(理中湯)의 주요 적응증인 설사와 구토 등을 주요 증상으로 포함하고 있는 위장관염증질환 중 최근 관심이 증폭되고 있는 크론병 등의 치료에 있어서, 염증의 완화를 위한, 염증촉발 인자의 생성억제는 흥미로운 접근으로 인식되고 있다 26) . 더욱이 홍삼(紅蔘)이 포함된 이중탕(理中湯)이 LPS로 유발된 각종 cytokine의 생성을 억제함에 대해서 보고 27) 한 바 있기 때문에, 본 연구에서는 백삼(白蔘)이 포함된 이중탕(理中湯)을 동결건조하여 얻은 물추출물(EJ)시료를 대상으로 하여, LPS로 마우스 대식세포 RAW 264.7을 자극하여 유발된 IL-2, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, MIP-2, VEGF, KC, TNF-α, GM-CSF의 과잉생성에 대한 영향에 대하여 알아보고자 하였다.
EJ가 10 ㎍/mL 이상의 농도에서 RAW 264.7에 유의한 세포 독성을 나타내지 않았음이 이미 보고 5) 된바가 있기 때문에 본 연구에서도 25, 50, 100 ㎍/mL의 농도로 EJ를 처리하였다.
본 연구의 실험결과 EJ는 LPS로 유발된 마우스 대식세포 RAW 264.7의 IL-2, IL-5, IL-12p70, MIP-2의 생성증가를 25, 50, 100 ㎍/mL의 농도에서 모두 유의하게 감소시켰으며, IL-6의 생성증가에 대해서는 50, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의하게 감소시켰고, IL-10과 VEGF의 생성증가에 대해서는 25, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의하게 감소시켰으며, KC의 생성증가에 대해서는 100 ㎍/mL의 농도에서 유의하게 감소시켰다. 이와 같은 실험결과는 EJ가 대식세포의 염증촉발인자과잉생성으로 인한 각종의 급만성염증질환의 완화, 예를 들면, IL-2와 IL-5의 증가로 인한 천식의 악화, MIP-2와 KC의 증가로 인한 폐렴악화, IL-12와 IL-6의 증가와 관련된 류마티스성관절염의 악화, IL-10과 VEGF의 증가로 인한 자궁내막증식증의 악화 등을 완화할 수 있는 항염효능이 있음을 의미하는 것으로 해석될 수 있을 것이다.
결 론
본 연구에서는 백삼(白蔘)이 포함된 이중탕(理中湯)을 동결 건조하여 얻은 물추출물(EJ)시료를 대상으로 LPS로 마우스 대식세포 RAW 264.7을 자극하여 유발된 다양한 cytokine의 과잉생성에 대한 영향을 알아보기 위하여 in vitro 실험을 수행한 결과 다음을 알 수 있었다.
EJ는 LPS로 유발된 마우스 대식세포 RAW 264.7의 IL-2, IL-5, IL-12p70, MIP-2의 생성증가를 25, 50, 100 ㎍/mL의 농도에서 모두 유의하게 감소시켰다(P < 0.5). EJ는 LPS로 유발된 마우스 대식세포 RAW 264.7의 IL-6 생성증가에 대해서는 50, 100 ㎍ /mL의 농도에서 유의하게 감소시켰다(P < 0.5). EJ는 LPS로 유발된 마우스 대식세포 RAW 264.7의 IL-10, VEGF 생성증가에 대해서는 25, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의하게 감소시켰다(P < 0.5). EJ는 LPS로 유발된 마우스 대식세포 RAW 264.7의 KC 생성증가에 대해서는 100 ㎍/mL의 농도에서 유의하게 감소시켰다(P < 0.5). 그러나 EJ는 LPS로 유발된 마우스 대식세포 RAW 264.7의 TNF-α와 GM-CSF의 생성증가에 대해서는 별다른 변화를 나타내지 않았다.
이와 같은 실험결과는 EJ가 대식세포의 IL-2, IL-5, IL-12p70, MIP-2, IL-6, IL-10, VEGF, KC 생성증가와 관련된 과잉염증반응을 조절할 수 있는 효능을 가지고 있음을 의미한다. 앞으로 EJ의 항염효능규명을 위한 보다 세밀한 연구가 요구되어지는 바이다.
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