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Relaxation Effect of Epimedium Koreanum Extract on Rabbit Carotid Artery
Relaxation Effect of Epimedium Koreanum Extract on Rabbit Carotid Artery
Journal of Physiology & Pathology in Korean Medicine. 2013. Dec, 27(6): 730-737
Copyright © 2013, The Korean Association of Oriental Medical Physiology
  • Received : June 30, 2013
  • Accepted : August 07, 2013
  • Published : December 25, 2013
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병진 노
선영 박
blbee@semyung.ac.kr

Abstract
The purpose of this study is to investigate vasorelaxant effect of Epimedium koreanum(EK) extract on rabbit carotid artery. In this study, to determine vasorelaxant effect of EK extract on rabbit carotid artery, arterial rings with intact or damaged endothelium were used for experiment using organ bath, and were contracted by norepinephrine(NE). After being contracted, arterial rings were treated with EK extract in a dose-dependent manner To study its mechanism, the contracted arterial rings induced by NE were pretreated with indomethacin(IM), Nω -nitro-L-arginine(L-NNA), methylene blue(MB) or tetraethylammonium chloride(TEA) and 0.1 ㎎/㎖ EK extract was added. To analyze the effect of the EK extract on influx of extracellular calcium chloride(Ca 2+ ) in rabbit carotid artery, in Ca 2+ -free krebs solution, krebs solution containing 1 mM Ca 2+ was infused into the contracted arterial ring by NE after pretreatment of EK extract. To measure the cytotoxicity of the EK extract, cell viability of human umbilical vein endothelial cell(HUVEC) was measured by MTT assay, and nitric oxide(NO) was measured by Griess reagent. The EK extract significantly was relaxed the arterial ring with intact endothelium contracted by NE, but the vasorelaxant effect of the EK extract was inhibited in the arterial rings with damaged endothelium. The vasorelaxant effect of the EK extract was not different between the IM-pretreatedand and non-treated arterial rings. The vasorelaxant effect of EK extract were significantly inhibited, when arterial rings were pretreated with L-NNA, TEA, MB. And in Ca 2+ -free krebs solution, increasing of arterial contraction by Ca 2+ addition were also inhibited by the treatment of EK, but not significant. The treatment of EK extract was increased NO concentration in HUVEC. This study suggested that the vasorelaxant effect of EK extract would be related with EDHF and NO production and increasing of cyclic GMP.
Keywords
서 론
고혈압은 원인 질환 없이 발생되는 본태성 고혈압과 신실질성 및 신혈관성 질환 등 여러 가지 원인이 복합적으로 작용하여 발생하는 이차성 고혈압으로 나뉘어진다 1) . 이 중 원인을 알 수 없는 본태성 고혈압이 약 90%를 차지하고 있고 뇌혈관 질환, 심장질환, 당뇨병 등 심혈관계 질환의 주된 원인이기도 하지만 단일 질병으로는 그 증상이 뚜렷이 나타나지 않아서 고혈압은 예방 및 치료가 어려운 질병 중의 하나이다 2 , 3) .
고혈압의 발생에 대한 많은 연구에서 고혈압 환자는 혈관의 기능장애 즉, 동맥경화증 및 내피세포의 기능장애가 관찰되었으며 혈관 내피세포의 수포 형성, 혈관 평활근의 구조적 변형과 비정상적인 이온 이동의 발생으로 인한 혈관의 비대가 고혈압의 병태생리로 밝혀져 고혈압의 발생에 혈관내피세포가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 4 , 5) .
혈관내피세포는 모든 혈관의 내강을 형성하는 단일 층의 특화된 상피세포로 신생 혈관의 성장을 촉진하는 물질을 분비하며, 혈액과 조직 사이의 물질 교환에 관여하고, 혈관을 수축하는 수축인자와 이완시키는 이완인자의 분비를 통해 말초저항을 유지함으로써 혈압의 조절에 관여된다 6) .
혈관내피세포내의 이완인자로는 prostacyclin, nitric oxide(NO), endotheliun derived hyperpolarization factor(EDHF)가 있으며 이들 인자들은 각기 다른 기전으로 혈관을 이완시킨다.
Prostacyclin은 내피세포에서 cyclooxygenase에 의해 arachidonic acid로부터 생성되는 물질로서 평활근에서 cyclic AMP를 활성화시켜 혈관을 이완시키고 7) , EDHF는 calcium-activated potassium channels의 활성화로 막전압을 과분극시켜 혈관을 이완시키며 8 , 9) , NO는 혈관내피세포에서 endothelial nitric oxide synthase(eNOS)에 의해 합성되어 혈관 평활근 내 cyclic GMP를 증가시킴으로써 세포내 Ca 2+ 농도를 감소시켜 혈관을 이완시키는 작용을 한다 10) .
淫羊藿은 매자나무과에 속하는 다년생 초본인 삼지구엽초 및 기타 동속 식물의 줄기와 잎을 여름과 가을 사이에 채취하여 건조한 것으로 性이 溫하고, 味는 辛甘하며 肝, 腎經으로 歸經하여 補腎壯陽, 祛風除濕의 효능으로 陽萎不擧, 小便淋瀝, 筋骨攣急, 半身不遂, 腰膝無力, 風濕痺痛, 四肢不仁등을 치료한다고 알려져 있으며, 대표적인 補陽藥의 하나이다 11) .
이러한 음양곽의 효능에 대한 연구로 간손상이 유발된 흰쥐에서 음양곽의 투여로 aspartate aminotransperase(AST), alanine aminotransperase(ALT), malonedialdehyde(MDA)가 감소하여 음양곽이 항산화 효과를 통해 간손상을 완화시킨다는 보고가 있었으며 12 - 16) , 음양곽 추출물이 간 이외의 다른 장기 즉, 신장 및 수컷 생식기에서도 손상을 효과적으로 억제 또는 치료한다는 연구 17) 와 음양곽이 thyroid-stimulating hormone(TSH) 분비를 증가시킴으로써 갑상선호르몬의 합성을 촉진시킨다는 연구 18 , 19) 가 있었다.
또한 최 등 20) 은 자발성고혈압흰쥐에 음양곽을 경구 투여함으로써 항고혈압효능을 측정하였고, 적출혈관에 대한 음양곽의 작용 및 ACE 저해작용 등을 관찰하여 음양곽이 직접적인 혈관 이완작용보다 ACE 저해활성을 통한 혈압강하 효과가 있음을 보고하였다.
이렇듯 최근 들어 음양곽의 심혈관계에 미치는 효과에 대해 많은 관심을 가지고, 연구가 진행되고 있으나 음양곽의 혈관이완 효과에 대한 직접적 작용 및 기전에 관한 연구는 미흡하다.
이에 저자는 토끼의 적출혈관을 이용한 organ bath study를 통하여 혈관내피세포에서 분비되는 EDHF, NO 및 prostacyclin을 중심으로 한 음양곽의 혈관이완효과에 대한 연구결과를 보고한 바 있으며 21) , 추가적으로 이완효과의 기전과 NO의 생성에 미치는 영향에 대한 연구에서 유의한 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.
재료 및 방법
- 1. 실험동물
체중 1.5 kg 내외의 Newzealand white 수컷 토끼(샘타코, 한국)를 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 1주 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 본 동물실험은 세명대학교 동물실험윤리위원회의 승인(smec 12-05-02)하에 실시되었다.
- 2. 음양곽 추출물 제조
음양곽(Epimedium koreanum) 200 g을 증류수 2000 ㎖과 함께 round flask에 넣고 2시간 동안 가열 추출한 다음 rotary evaporator(Eyela, Japan)로 감압 농축하였다. 농축액을 동결건조기로 건조하여 얻은 23.4 g의 분말을 실험에 사용하였으며 음양곽 추출물의 수율은 11.7%로 나타났다.
- 3. 혈관이완 기전에 관한 실험
- 1) 혈관절편의 제작
토끼를 urethane(0.6g/㎏, 정맥주사)으로 마취한 후 경부를 절개하고 경동맥을 적출하여 modified krebs-ringer bicarbonate solution(125.4 mM NaCl, 4.9 mM KCl, 2.8 mM CaCl 2 , 1.2 mM MgSO 4 , 15.8 mM NaHCO 3 , 1.2 mM KH 2 PO 4 , 12.2 mM glucose, pH 7.4)에 담았다. 경동맥은 혈관주위의 지방조직을 제거하고 2㎜ 길이가 되도록 횡으로 절단하여 고리모양의 혈관절편을 만들었다. 혈관절편은 내피세포가 존재하는 절편과 내피세포가 제거된 절편으로 구분하여 제작하였으며, 내피세포의 제거는 가는 솜 막대로 문질러 제거하였다 22) .
- 2) 등장성 수축 측정
혈관절편은 95%의 O 2 와 5%의 CO 2 혼합가스로 포화된 37℃의 modified krebs-ringer bicarbonate solution이 peristaltic pump를 통하여 3 ㎖/min의 속도로 흐르고 있는 organ bath(용량 1.5 ㎖)에 현수하였다. 혈관절편의 한쪽 끝은 organ bath의 바닥에 고정시키고 다른 쪽은 force transducer에 연결하여 장력을 측정하고 그 결과를 physiograph(PowerLab, Australia)로 기록하였다 23) . 실험시작 전 혈관절편을 organ bath에서 1시간 안정시킨 후 micromanipulator (Narishige N2, Japan)를 이용하여 피동장력 1 g을 가하고 다시 1시간 안정시킨 다음 실험을 진행하였으며, 연속되는 실험에는 다른 처치 전에 다시 1시간 안정시킨 다음 시행하였다 24) .
- (1) Norepinephrine(NE)으로 수축된 혈관에서의 이완효과 측정
혈관절편에 5 μ M NE를 투여하여 수축을 유발시킨 다음 음양곽 추출물을 농도별(0.01, 0.03, 0.1 ㎎/㎖)로 투여하여 이완효과의 변화를 기록하였다.
- (2) 혈관내피세포 유무에 따른 이완효과의 변화 측정
혈관내피세포가 존재하는 혈관절편과 혈관내피세포가 제거된 혈관절편에 5 μ M NE를 투여하여 수축을 유발시킨 다음 음양곽 추출물(0.1 ㎎/㎖)을 투여하여 이완효과의 변화를 비교하였다.
- (3) Indomethacin(IM)의 전처치에 따른 이완효과의 변화 측정
혈관절편을 10 μ M IM으로 10분간 전처치하고 5 μ M NE를 투여하여 수축을 유발시킨 다음 음양곽 추출물(0.1 ㎎/㎖)을 투여하여 IM을 전처치하지 않은 경우와 이완효과의 변화를 비교하였다.
- (4) Tetraethylammonium chloride(TEA)의 전처치에 따른 이완효과의 변화 측정
혈관절편을 10 μ M TEA로 10분간 전처치하고 5 μ M NE를 투여하여 수축을 유발시킨 다음 음양곽 추출물(0.1 ㎎/㎖)을 투여하여 TEA를 전처치하지 않은 경우와 이완효과의 변화를 비교하였다.
- (5) Nω-nitro-L-arginine(L-NNA)의 전처치에 따른 이완효과의 변화 측정
혈관절편을 10 μ M L-NNA로 10분간 전처치하고 NE 5 μ M를 투여하여 수축을 유발시킨 다음 음양곽 추출물(0.1 ㎎/㎖)을 투여하여 L-NNA을 전처치하지 않은 경우와 이완효과의 변화를 비교하였다.
- (6) Methylene blue(MB)의 전처치에 따른 이완효과의 변화 측정
혈관절편을 1 μ M MB로 10분간 전처치하고 NE 5 μ M를 투여하여 수축을 유발시킨 다음 음양곽 추출물(0.1 ㎎/㎖)을 투여하여 MB를 전처치하지 않은 경우와 이완효과의 변화를 비교하였다.
- (7) 음양곽의 전처치에 따른 Ca2+의존성 수축변화 측정
혈관절편을 Ca 2+ -free solution에서 0.1 ㎎/㎖ 음양곽 추출물로 10분간 전처치하고 5 μ M NE를 투여하여 수축을 유발시킨 다음 1 mM Ca 2+ 을 투여하여 음양곽을 전처치하지 않은 경우와 수축의 변화를 비교하였다.
- 3) 세포실험
사람의 제대정맥내피세포인 human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)은 CloneticsTM and PoieticsTM (Lonza, USA)에서 구입하여 passage 3~7번까지 사용하였으며, 세포배양을 위해 endothelial cell basal medium-2(EBM-2) bullet kit (Lonza, USA)을 이용하여 37℃, 5% CO 2 조건하에서 배양하였다. EBM-2 배지는 사용 전 EGM-2 Single Quots(10% fetal bovine serum, hydrocortisone, hFGF-B, vEGF, R3-IGF-I, ascorbic acid, hegf. GA-1000, heparin)을 넣고 잘 섞어서 사용하였다. 70~80%정도 포화된 HUVEC은 HEPES-buffered saline solution을 주입하여 씻어내고, trypsin/EDTA solution(2 ㎖)을 넣어 flask에 부착된 세포를 떼어낸 후 trypsin neutralizing solution을 첨가하여 원심분리(220×g, 5분)하였다. 침전물에 새로운 배지를 넣어서 cell count하여 세포를 96-well plate(1×10 4 cells/well)에 심은 다음 24시간 동안 CO 2 incubator에서 배양하였다.
- (1) 세포독성 측정
Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 배지로 37℃, 5% CO 2 하에서 24시간 배양한 HUVEC에 음양곽 추출물을 농도별로 처리한 다음 24시간 배양하여 세포생존율을 MTT assay로 측정하였다 25) . MTT (methylthiazol-2-yl-2,5- diphenyl tetrazolium bromide, 5 ㎎/㎖)를 20 ㎕ 넣고, 세포배양기에서 2시간 방치하였다. 상층액을 제거한 뒤 formazan 침전물은 DMSO를 200 ㎕씩 넣어 약 15분간 녹였다. 540 ㎚의 파장에서 ELISA microplate reader로 흡광도를 측정하여 세포생존율을 계산하였다.
- (2) Nitric oxide 측정
Nitric Oxide(NO) 생성 정도는 Griess reaction 26) 에 준하여 microplate reader로 NO 생성의 지표인 배지에 생성된 nitrite 양을 측정하여 결정하였다. 음양곽 처리 24시간 후에 배양액 50 ㎕에 Griess reagent (1% sulfanilamide, 0.1% naphtylethylene diamide 및 2.5% 인산)를 동량 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 550 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. Nitrite 양의 측정은 sodium nitrite를 농도별로 조제하여 만든 표준곡선을 이용하여 산출하였고, 생성된 nitrite의 양은 μ M로 환산하여 나타내었으며 각 실험에서 기본 대조군은 세포 배양액을 사용하였다.
- 4. 통계처리
실험결과는 평균과 표준편차로 나타내었으며, 혈관수축의 변화는 실제 수축의 크기와 NE로 유발된 최고 수축에 대한 백분율로 표현하였다. 실험결과의 비교는 student's t-test를 시행하였고, 유의성은 P<0.05로 판정하였다.
결 과
- 1. NE로 수축된 혈관에서의 수축변화
NE에 의한 최대 수축이 1.15±0.17 g이었는데, 음양곽 추출물 투여 시 농도의존적으로 이완효과가 나타났다. 0.01 ㎎/㎖ 음양곽 추출물 투여 시 0.68±0.39 g(57.8%), 0.03 ㎎/㎖ 음양곽 추출물 투여 시 0.26±0.13 g(22.6%), 0.1 ㎎/㎖ 음양곽 추출물 투여 시 0.24±0.10 g(20.9%)으로 모든 농도에서 유의성 있는 이완효과를 나타내었다.
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EK extract-induced concentration-dependent relaxation in isolated rabbit common carotid artery. Representative tracings show that relaxation of arterial ring by cumulative addition of 0.01 ㎎/㎖ to 0.1 ㎎/㎖ EK extract at the plateau of NE-induced contraction. NE, 5 μM norepinephrine; EK, Epimedium koreanum extract(㎎/㎖); WO, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.
- 2. 내피세포 유무에 따른 이완효과의 변화
혈관내피세포를 제거하지 않은 경우 NE에 의한 최대수축 1.15±0.17 g에 비해 0.1 ㎎/㎖ 음양곽 추출물 투여 시 0.24±0.10 g(20.9%)으로 유의성 있는 이완효과를 나타내었다. 혈관내피세포를 제거한 경우 NE에 의한 최대수축 1.56±0.21 g에 비해 0.1 ㎎/㎖ 음양곽 추출물 투여 시 1.63±0.25 g(104.9%)으로 음양곽의 이완효과는 관찰되지 않았다.
- 3. IM의 전처치에 따른 이완효과의 변화
IM을 전처치하지 않은 경우 NE에 의한 최대수축 1.02±0.28 g에 비하여 0.1 ㎎/㎖ 음양곽 추출물 투여 시 0.54±0.25 g(45.3%)의 수축으로 유의성 있는 이완효과를 나타내었다. 반면 IM을 전처치한 경우 NE에 의한 최대수축 1.00±0.26 g에 비하여 0.1 ㎎/㎖ 음양곽 추출물 투여 시 0.52±0.30 g(43.5%)의 수축으로 유의성 있는 이완효과를 나타내었다. IM을 전처치하지 않은 경우와 IM을 전처치한 경우를 비교하였을 때 유의성 있는 차이를 보이지 않았다.
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EK extract-induced endothelium-dependent or independent relaxation in isolated rabbit common carotid artery. Representative tracings show that relaxation of arterial ring by EK extract at the plateau of NE-induced contraction in ED-intact or ED-denuded arterial ring. NE, 5 μM norepinephrine ; EK, Epimedium koreanum extract(㎎/㎖) ; ED, endothelium ; WO, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.
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Effects of pretreatment of IM on the endothelium-dependent relaxation induced by EK extract. Representative tracings show that relaxation of arterial ring by EK extract at the plateau of NE-induced contraction in IM treated or IM non-treated arterial ring. NE, 5 μM norepinephrine ; EK, Epimedium koreanum extract(㎎/㎖) ; IM, 10 μM indomethacin ; WO, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.
- 4. TEA의 전처치에 따른 이완효과의 변화
TEA를 전처치하지 않은 경우 NE에 의한 최대수축 0.98±0.31 g에 비하여 0.1 ㎎/㎖ 음양곽 추출물 투여 시 0.45±0.25 g(41.8%)의 수축으로 유의성 있는 이완효과를 나타내었다. 반면 TEA를 전처치한 경우 NE에 의한 최대수축 0.76±0.27 g에 비하여 0.1 ㎎/㎖ 음양곽 추출물 투여 시 0.81±0.39 g(115.9%)의 수축으로 이완효과가 관찰되지 않았다. TEA를 전처치하지 않은 경우와 TEA를 전처치한 경우를 비교하였을 때 TEA를 전처치한 경우가 TEA를 전처치하지 않은 경우에 비하여 이완효과가 유의하게 억제되었다.
- 5. L-NNA의 전처치에 따른 이완효과의 변화
L-NNA를 전처치하지 않은 경우 NE에 의한 최대수축 1.01±0.26 g에 비하여 0.1 ㎎/㎖ 음양곽 추출물 투여 시 0.42±0.23 g(40.1%)의 수축으로 유의성 있는 이완효과를 나타내었다. 반면 L-NNA를 전처치한 경우 NE에 의한 최대수축 1.06±0.22 g에 비하여 0.1 ㎎/㎖ 음양곽 추출물 투여 시 1.20±0.28 g(113.8%)의 수축으로 이완효과가 관찰되지 않았다. L-NNA를 전처치하지 않은 경우와 L-NNA를 전처치한 경우를 비교하였을 때 L-NNA를 전처치한 경우가 L-NNA를 전처치하지 않은 경우에 비하여 이완효과가 유의하게 억제되었다.
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Effects of pretreatment of TEA on the endothelium-dependent relaxation induced by EK extract. Representative tracings show that relaxation of arterial ring by EK extract at the plateau of NE-induced contraction in TEA treated or TEA non-treated arterial ring. NE, 5 μM norepinephrine ; EK, Epimedium koreanum extract(㎎/㎖) ; TEA, 10 μM tetraethylammonium chloride ; WO, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.
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Effects of pretreatment of L-NNA on the endothelium-dependent relaxation induced by EK extract. Representative tracings show that relaxation of arterial ring by EK extract at the plateau of NE-induced contraction in L-NNA treated or L-NNA non-treated arterial ring. NE, 5 μM norepinephrine ; EK, Epimedium koreanum extract(㎎/㎖) ; L-NNA, 10 μM Nω-nitro-L-arginine ; WO, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.
- 6. MB의 전처치에 따른 이완효과의 변화
MB를 전처치하지 않은 경우 NE에 의한 최대수축 1.09±0.36 g에 비하여 0.1 ㎎/㎖ 음양곽 추출물 투여 시 0.51±0.40 g(41.8%)의 수축으로 유의성 있는 이완효과를 나타내었다. 반면 MB를 전처치한 경우 NE에 의한 최대수축 1.00±0.30 g(100%)에 비하여 0.1 ㎎/㎖ 음양곽 추출물 투여 시 0.98±0.34 g(97.7%)의 수축으로 이완효과가 관찰되지 않았다. MB를 전처치하지 않은 경우와 MB를 전처치한 경우를 비교하였을 때 MB를 전처치한 경우가 MB를 전처치하지 않은 경우에 비하여 이완효과가 유의하게 억제되었다.
- 7. 음양곽의 전처치에 따른 Ca2+의존성 수축의 변화
Ca 2+ 이 제거된 krebs-ringer solution에서 음양곽을 전처치하지 않은 상태에서 NE의 투여로 수축을 유발시킨 후 1 mM Ca 2+ 을 투여하였을 때 0.79±0.27 g의 수축을 나타내었다. 음양곽을 전처치한 상태에서 NE의 투여로 수축을 유발시킨 후 1 mM Ca 2+ 을 투여하였을 때 0.68±0.42 g의 수축을 나타내었다. Ca 2+ 투여로 인한 수축의 증가는 음양곽의 전처치에 의해 감소되었지만 유의성이 나타나진 않았다.
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Effects of pretreatment of MB on the endothelium-dependent relaxation induced by EK extract. Representative tracings show that relaxation of arterial ring by EK extract at the plateau of NE-induced contraction in MB treated or MB non-treated arterial ring. NE, 5 μM norepinephrine ; EK, Epimedium koreanum extract(㎎/㎖) ; MB, 1 μM methylene blue ; WO, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.
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Effects of EK extract on influx of extracellular Ca2+ in isolated rabbit common carotid artery. Representative tracings show that in Ca2+-free krebs-ringer solution, contraction of arterial ring by Ca2+ at the plateau of NE-induced contraction in EK extract treated or EK non-treated arterial ring. NE, 5 μM norepinephrine ; Ca2+, 1 mM calcium chloride ; EK, Epimedium koreanum extract(㎎/㎖) ; WO, wash out or change of bath medium with a solution to which no drug is applied.
- 8. 음양곽의 세포독성 측정
Human umbilical vein endothelial cell(HUVEC)에 음양곽 추출물을 농도별로 24시간 처치한 후 MTT assay를 통해 세포 생존율을 측정한 결과 음양곽 추출물 100, 500, 1000 ㎍/㎖ 농도에서 세포 생존율이 유의하게 감소되었다.
- 9. 음양곽이 NO의 생성에 미치는 영향
Human umbilical vein endothelial cell(HUVEC)에 음양곽 추출물을 농도별로 24시간 처치하였을 때 control에서 측정된 NO 량인 2.10±0.38 μ M에 비하여 500 ㎍/㎖ 음양곽 추출물 처리 시 4.01±0.10 μ M, 1,000 ㎍/㎖ 음양곽 추출물 처리 시 6.84±0.21 μ M의 NO가 측정되어 유의성 있는 증가를 보였다.
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Effects of EK extract on the viability of HUVEC. Representative bars are shown as the cell viability in HUVEC by EK extract(10, 100, 500 and 1,000 ㎍/㎖) treated for 24 hr at 37℃. Values are mean±standard deviation. EK, Epimedium koreanum extract ; ** p<0.005 ; *** p<0.001 compared with control.
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Effects of EK extract on nitric oxide concentration in HUVEC. Representative bars are shown as the nitric oxide concentration in HUVEC by EK extract(10, 100, 500 and 1,000 ㎍/㎖) treated for 24 hr at 37℃. Values are mean±standard deviation. EK, Epimedium koreanum extract ; NO, nitric oxide ; *** p<0.001 compared with control.
고 찰
실험결과 NE에 의한 최대수축에 대하여 0.01, 0.03, 0.1 ㎎/ ㎖ 음양곽 추출물 처리 시 유의성 있는 이완효과를 나타내었고, 내피세포를 제거한 경우엔 이완효과가 관찰되지 않았다. 이를 통해 음양곽의 혈관이완효과가 내피세포 의존성으로 일어난다는 사실을 알 수 있다.
내피세포성 혈관이완인자는 prostacyclin, EDHF, NO가 있는데, 이러한 혈관이완인자는 정상 상태에서도 내피세포에서 합성 및 분비되며 acetylcholine, histamine, substance P 및 isoproterenol 등에 의해서도 합성 및 분비가 증가된다 7) .
먼저 음양곽이 prostacyclin의 작용과 관련이 있는지 알아보기 위하여 arachidonic acid로부터 prostacyclin이 생성되는 것을 차단하는 것 27) 으로 알려져 있는 IM을 이용하여 실험하였다. 음양곽 추출물 0.1 ㎎/㎖을 투여하였을 때 IM을 전처치하지 않은 경우와 IM을 전처치한 경우 모두에서 유의성 있는 이완효과가 나타났다. 이로써 음양곽의 혈관이완효과가 prostacyclin의 작용을 통해 일어나지 않음을 알 수 있다.
음양곽의 혈관이완효과가 EDHF의 역할과 관련이 있는지 알아보기 위하여 K + channel blocker로 알려진 TEA 28 - 30) 를 이용하여 EDHF에 의해 일어나는 막전압의 과분극을 차단하였다. 그 결과 TEA를 전처치하지 않은 경우 음양곽 추출물을 투여하였을 때 유의성 있는 이완효과를 나타내었으나 TEA를 전처치한 후에는 이완효과가 나타나지 않았다. 즉, TEA를 전처치하지 않은 경우와 TEA를 전처치한 경우를 비교해보았을 때 TEA를 전처치한 경우에 TEA를 전처치하지 않은 경우에 비해 이완효과가 유의하게 억제되었다. 이로써 EDHF의 혈관을 이완시키는 작용과 음양곽의 혈관이완작용이 연관되어 있다는 것을 알 수 있다.
음양곽의 혈관이완효과가 NO의 역할과 관련이 있는지 알아보기 위하여 혈관내피세포에서 NOS의 inhibitor로 작용하여 NO의 생성을 막는 것으로 알려져 있는 L-NNA 31 , 32) 와 내피세포에서 생성된 NO가 혈관평활근으로 가서 soluble guanylyl cyclase를 활성화시킴으로써 GTP가 cyclic GMP로 전환되는 것을 차단하는 것으로 알려져 있는 MB 33) 를 사용하였다.
먼저 L-NNA를 전처치한 경우와 전처치하지 않은 경우를 비교해보았을 때 L-NNA를 전처치하지 않은 경우 유의성 있는 이완효과를 나타내었으나 L-NNA를 전처치한 경우 이완효과가 억제되었다. 즉 L-NNA를 전처치한 경우에 L-NNA를 전처치하지 않은 경우에 비해 이완효과가 유의하게 억제된 것이다. 이는 L-NNA에 의하여 L-arginine으로부터 NO의 생성이 억제되어 혈관이완효과가 나타나지 않은 것으로써 음양곽이 NOS에 의한 NO의 생성에 영향을 미쳐 혈관이완효과를 나타내는 것으로 판단된다.
김 등 34) 은 쥐의 대동맥에 20가지의 한약재를 투여하여 혈관이완효과를 알아보았는데 그 중 음양곽이 내피세포의 제거와 L-NNA의 처치에 의해 혈관의 이완을 유의하게 억제하였다. 이러한 결과는 앞서 진행된 실험의 결과와 일치하며 음양곽의 혈관이완효과가 NO의 생성에 의해 이루어진다는 것을 더욱 뒷받침해준다.
또한 MB를 전처치한 경우와 전처치하지 않은 경우를 비교해보았을 때 MB를 전처치하지 않은 경우 음양곽 추출물을 투여하였을 때 이완효과가 유의성 있게 나타난 반면 MB를 전처치한 경우엔 이완효과가 억제되어 나타났다. 이 결과를 통해 음양곽이 생성된 NO에 의한 cyclic GMP의 증가를 통해 혈관이완효과에 관여하는 것으로 판단된다.
Ca 2+ 은 수축을 야기하는 스위치 역할 뿐만 아니라 수축력을 조절하는 인자로 Ca 2+ 통로의 차단은 세포내 Ca 2+ 농도를 감소시킴으로써 혈관을 이완시킨다.
세포외 Ca 2+ 의 유입과 음양곽의 혈관이완작용의 상관성을 알아보기 위하여 Ca 2+ 이 제거된 상태의 krebs-ringer solution에서 NE로 수축을 유발시킨 후 Ca 2+ 1 mM을 투여해보았다. 음양곽을 전처치한 경우와 음양곽을 전처치하지 않은 경우를 비교하였을 때 Ca 2+ 투여로 인한 수축의 증가는 음양곽의 전처치에 의해 감소되었지만 유의성이 나타나진 않았다. 이로써 음양곽이 혈관을 이완시키는 작용이 세포외 Ca 2+ 의 유입과는 관련이 없다고 판단할 수 있으나 결과가 유의성만 나타나지 않았을 뿐 감소되는 추세에 있으므로 추후 추가실험이 필요할 것으로 생각된다.
Human umbilical vein endothelial cell(HUVEC)에 음양곽 추출물을 농도별로 24시간 처치한 후 MTT assay를 통해 세포 생존율을 측정하였을 때 음양곽 추출물 100, 500, 1000 ㎍/㎖ 농도에서 세포 생존율이 유의하게 감소되었다. 이는 음양곽 추출물이 세포에 대하여 일정 부분 독성이 있다고 생각할 수 있으나 평균적으로 70 ~ 80%의 생존율을 나타내었으므로 정확한 독성여부에 관해서는 자세히 실험을 추가해봐야할 것이다.
또한 HUVEC에 음양곽 추출물을 농도별로 24시간 처치한 후 생성된 NO 량을 측정하였을 때 control에 비하여 음양곽 추출물을 투여한 다음에 NO의 생성이 유의성 있게 증가되었다. 이를 통해 음양곽이 혈관내피세포에서 NO의 생성을 증가시킨다는 사실을 알 수 있다.
이상의 실험결과에서 음양곽은 내피세포 의존성으로 혈관이완효과를 가지고 있으며 혈관을 이완시키는 기전은 EDHF를 통해 막전압을 과분극시키고 NOS로부터 NO의 생성을 도우며, NO의 생성을 통해 cGMP를 증가시키는 기전에 의한 것으로 판단된다.
따라서 음양곽은 혈관수축에 의한 혈압상승 시 직접적인 혈관이완효과를 통해 심혈관계 질환에 폭넓게 응용할 수 있을 것으로 사료된다.
결 론
음양곽의 혈관이완효과 및 그 기전을 알아보기 위하여 혈관내피세포성 이완인자를 중심으로 실험을 진행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
음양곽은 NE로 수축시킨 혈관에 대해 유의성 있는 이완효과를 나타내었으며 내피세포를 제거한 경우 음양곽의 혈관이완효과는 내피세포를 제거하지 않은 경우에 비해 유의하게 억제되어 나타났다. 또한 음양곽의 혈관이완효과는 IM의 전처치 유무에 상관없이 유의성 있게 나타났으나 TEA와 L-NNA, MB의 전처치에는 유의성 있게 억제되어 나타났다. Ca 2+ 을 제거한 krebs-ringer solution에서 음양곽의 전처치는 Ca 2+ 의 첨가에 의한 수축의 증가를 억제하였으나 유의성이 관찰되진 않았으며, Human umbilical vein endothelial cell(HUVEC)에 음양곽 추출물을 농도별로 24시간 처치한 후 NO 량을 측정하였을 때 음양곽 추출물을 투여한 경우 control에 비해 NO의 생성이 유의하게 증가된 것이 관찰되었다.
실험결과 음양곽은 혈관내피세포에서 NO의 생성과 평활근에서 cGMP를 증가시키고, EDHF를 통해 세포막의 막전압을 과분극시킴으로써 혈관을 이완시키는 것으로 생각된다.
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