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The Comparative Study on Anti-inflammatory Antioxidant and Antibacterial Effects with Regard to the Extraction Solvents of Ligustici Rhizoma
The Comparative Study on Anti-inflammatory Antioxidant and Antibacterial Effects with Regard to the Extraction Solvents of Ligustici Rhizoma
Journal of Pharmacopuncture. 2011. Jan, 14(1): 71-78
Copyright ©2011, KOREAN PHARMACOPUNCTURE INSTITUTE
  • Received : January 29, 2011
  • Accepted : February 22, 2011
  • Published : January 30, 2011
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BoMin Hwang

Abstract
Objective :
This study was performed to compare anti-inflammation, anti-oxidation and anti-bacterial effects of Ligustici Rhizoma (LR) extracted with two kinds of solvents, ethanol and distilled water.
Methods :
It is prepared two kinds of LR extracts 20, 50, 100 ℃/㎎ by first. MTT assay way to measure cytotoxicity is formed in Raw 264.7 cell. The anti-inflammation effect is measured by ability to inhibit production of NO in Raw 264.7 cell. The anti-oxidation effect was measured by DPPH Radical scavenging ability in HaCaT cell. The anti-bacterial effect was measured by inhibition zone diameter on Propionibacterium acnes .
Results :
1. LR (20 ㎕/㎎) extracted with ethanol was showed 80% cytotoxicity, LR (50 ㎕/㎎) extracted with ethanol and LR (20, 50 ㎕/㎎) extracted with water were showed 70% cytotoxicity, LR (100 ㎕/㎎) extracted with ethanol and LR (100 ㎕/㎎) extracted with water were showed 60% cytotoxicity in Raw 264.7 cell. 2. LR (100 ㎕/㎎) extracted with ethanol was showed more significantly inhibitory effect on NO production than the water extraction. 3. Two kinds of LR extraction groups did not show significantly scavenging effect of DPPH radicals. 4. Two kinds of LR extractions did not have a inhibitory effect on Propionibactrium acnes .
Conclusion :
Two kinds of LR extracts have not cytotoxicity, statistically significant ability to scavenge DPPH radicals and effect to inhibit Propionibactrium acnes . LR extracted with ethanol only have a little effect to inhibit NO production. This study proposes that LR extracted with ethanol is more effective in anti-inflammation.
Keywords
Ⅰ. 緖 論
복잡해진 현대 사회에서 한의학적 치료 영역에서도 시대에 맞게 다양한 변화가 시도되어야 하나, 아직 한의학적 치료는 韓藥, 鍼灸, 附缸과 같은 전통적인 치료에 많은 부분이 할애되어 있다. 인체의 외적 부분에 질병이 표현되는 한방피부과 영역에서의 치료는 외용적 치료가 부가적으로 이루어져야 함에도 불구하고, 현재에도 전통적인 한의학적 치료에서 벗어나지 못하고 있는 실정이다. 환자의 만족도, 치료의 유효성을 높이기 위해서라도 임상현장에서 실제적으로 이용될 수 있는 외용적 치료제 및 치료기술의 개발이 적극적으로 필요하다.
한방피부과에서 손쉽게 활용할 수 있는 외용적 치료방법 중 하나는 도포법이다. 한약을 이용한 외용도포법을 임상에 활용할 경우 細末한 약제와 혼합할 용매가 필요하며, 용매는 자극성을 줄일 것인지, 혈액순환을 촉진 할 것인지, 영양을 보충할 것인지 등에 따라 아주 다양한 용매들을 이용할 수 있으며, 한의학에서도 환자 및 질병의 상태에 따라 혼합할 용매를 선택적으로 사용하였다.
藁本은 沐藥하는 방법으로 酒?, 粉刺 등의 염증을 치료하는 외용 치료제이다 1) . 沐藥法을 활용하기 위해서는 細末한 약제와 혼합할 용매가 필요하며, 사용될 수 있는 용매로는 예전부터 흔히 水, 酒, 醋, 蜜 등이 이용되어 왔다. 이러한 용매는 자극성을 줄일 것인지, 혈액순환을 촉진 할 것인지, 영양을 보충할 것인지 등에 따라 선택될 수 있다 2) .
한의학적으로는 주로 환자 및 질병의 상태에 따라 혼합할 용매를 선택하여 사용하여 왔다. 그러나 최근 들어 다양한 종류의 추출용매가 등장하고 추출물의 효능을 연구하는 방법들이 개발되면서 추가적으로 고려되어야 할 사항으로 동일 약제라 하여도 추출용매에 따라 추출성분과 효능의 정도가 달라 질 수 있다는 것이며, 이와 관련된 연구 3 - 7) 가 여러 분야에서 보고 되고 있다 2) .
이에 본 연구는 안면의 염증성 피부질환에 도포용 치료제로 사용하기 위하여 粉刺를 치료하는 것으로 소개되고 1) 항염증 효과가 있는 것으로 연구된 8) 藁本을 에탄올과 물로 추출하여 세포독성, NO 생성 저해능, DPPH 소거능, 항균 효능을 비교하여 추출용매에 따른 차이를 알아보고 藁本을 외용 치료제로 사용할 경우의 임상적 활용가치를 높이고자 하였다.
Ⅱ. 實驗材料 및 方法
- 1. 材料
- 1) 약물
실험에 사용한 藁本(LR)은 상지대학교부속한방병원 약제과에서 국산으로 구입하여 세척한 후 실험에 사용하였다.
- 2) 균주 및 세포주
세포독성 및 항염에 사용된 Raw 264.7 cell(Mouse Macrophage cell line)은 한림대학교 TIC, 항산화에 사용된 HaCaT cell(Human Keratinocyte cell line)은 강원대학교 생화학과, 항균실험에 사용한 균주인 여드름 유발균주 Propionibacterium acnes (KCTC 3314)은 한국 생명 공학 연구원 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다.
- 3) 시약 및 기기
실험에 사용된 3-(4,5-dimethylthiazol-2-gel)- 2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), N G -methyl-L-arginine acetate salt(L-NMMA), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), Lipopolysaccharide(LPS)는 Sigma(USA), Fetal Bovine Serum(FBS), Penicillin-Streptomycin, Dulbecco's modified Egale's medium(DMEM)/High glucose는 Hyclone(USA), Dimethyl sulfoxide(DMSO), 2-propanol Hueller-Hinton Broth은 Merck(USA)에서 구입하여 사용하였고, ELISA reader(Perkin-Elmer, Foster City, CA), Spectrophotometer(UNICO.. USA), Micro centrifuge(Hettich, Germany) 등의 기기를 실험에 사용하였다.
- 2. 방법
- 1) 시료조제
LR 112 g을 분쇄기를 이용해 細末하고 56 g씩 나누어, 에탄올 추출물은 70% EtOH 500㎖와 혼합하여 교반기로 25℃에서 180분 동안 추출하고, 열수 추출물은 2차 증류수 1 ℓ와 혼합하여 약탕기로 100℃에서 150분 동안 전탕한 후 추출하였다. 각 추출물을 여과지(Whatman 4 → ADVANTEC 5C)로 여과한 후 여과액을 회전감압농축기를 이용하여 완전 농축하고 에탄올 추출물은 50℃에서 EtOH 제거후 70℃에서 H 2 O를 제거하였고, 열수 추출물은 70℃에서 H2O를 제거하여 각각 3.56 g(수율 6.36%), 2.28 g(수율 4.07%)의 시료를 얻었다. LR을 microtube에 담은 후 100% DMSO를 이용하여 20 ㎎/㎖의 농도로 만들고 실험에 사용하였다.
- 2) 균주 및 세포 배양
Raw 264.7 cell을 10% fetal bovine serum, penicillin(100 units/㎖), streptomycin(100 units/㎖)이 첨가된 DMEM 배지로 5% CO 2 , 37℃에서 배양하였으며, 배지는 3~4일 간격으로 교체하고 배양용기에 90%이상 자라면 계대 배양하여 실험에 사용하였다 9) . 항균실험에 사용한 여드름 유발균주 Propionibacterium acnes(KCTC 3314)을 Reinforced-clostridial Broth를 사용하여 37℃, incubator에서 72시간 동안 배양하였다. 항균성 실험에 사용한 고체배지는 각 배지의 Agar를 사용하였다 10) .
- 3) 세포 독성 측정
Raw 264.7 cell을 배양접시 바닥에 접종한 후, Penicillin(100 U/㎖), Streptomycin(100 ㎍/㎖), 10% FBS를 함유한 DMEM배지를 넣고 37℃, 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기에서 배양하였다. Raw 264.7 cell을 96well plate에 5×10 5 /㎖의 농도로 희석하여 100 ㎕씩 접종한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 모두 제거하고 혈청이 포함되지 않은 배지 90 ㎕씩을 각 well에 넣고 LR의 농도가 20, 50, 100 ㎍/㎖가 되도록 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 희석한 시료를 10 ㎕씩 well에 처리하여 주었다. 24시간 배양 후 PBS를 이용하여 5 ㎎/㎖의 농도로 녹여져 있는 MTT 시약을 20 ㎕씩 넣어주고 4시간 배양하였다. MTT 시약과 시료가 포함된 배지를 모두 제거하고 각 well에 100 ㎕ acid isopropanol(0.04N HCl in iso-propanol)을 첨가하여 30분간 교반하고, ELISA reader를 이용하여 570 ㎚에서 흡광값을 측정하였다 11) .
- 4) NO 생성 저해 효능 측정
96 well plate에 well당 5×10 5 /㎖의 Raw 264.7 cell이 들어있는 부유액 100 ㎕를 넣고 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 무혈청 배지에 최종 농도가 20, 50, 100 ㎍/㎖가 되도록 LR을 처리한 후 LPS를 100 ng/㎖의 농도로 처리하였다. 24시간 배양 후 배지를 이용하여 NO의 생성을 측정하였다 12) . 세포배양액 50 ㎕와 Griess시약 50 ㎕를 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 NO 생성 억제제인 NMMA를 50 uM이 되도록 시료와 같은 방법으로 처리하여 NO 생성 저해 효능을 비교하였다.
- 5) DPPH Radical 소거능 측정
DPPH를 메탄올에 용해시켜 0.1 mM DPPH 용액 1 ㎖에 LR을 20, 50, 100 ㎍/㎖ 농도별로 만들어 1 ㎖씩 넣어주고 잘 혼합한 후, 실온에서 10분 동안 반응시킨 뒤 565 ㎚에서 흡광도를 측정하였다 13) . 양성 대조군으로 Quercetin 20 ㎍/㎖ 사용하여 같은 방법으로 처리하여 DPPH Radical 소거효과를 비교하였다.
- 6) 항균 효능 측정
10% DMSO에 stock되어 -70℃에 보관되어 있는 균주를 백금이를 이용하여 agar plate에 streaking하여 37℃ 에서 72시간 배양 하였다. 생성된 colony 하나를 백금이를 이용하여 broth배지에 접종하고 72 시간 동안 200 rpm, 37℃ shaking incubator에서 전배양 하였다. 전배양한 균 현탁액을 준비하고 이를 배양 액체배지로 희석하여 1.5×10 8 cells/㎖의 농도로 준비하였고 균 희석액을 미리 준비해 둔 agar plate에 굳기 직전의 배지와 혼합하여 굳을때까지 정치하였다. 충분히 굳은 고체배지 위에 멸균된 paper disk를 올려놓은 후 20 ㎎/㎖의 농도로 희석되어진 시료를 disk에 loading 하였다. 50 ㎕/disk의 농도로 10분간 정치하여 시료가 모두 배지에 확산되어 흡수된 후, 균의 생장 최적 온도인 37℃에서 72시간 동안 배양하여 균의 생장 억제환의 직경을 측정하여 항균 활성을 측정하였다 14) .
- 7) 통계분석
실험 결과는 SPSS 10.0 for Windows를 사용하여 평균±표준편차로 표기하고 유의수준은 p≺0.05로 하였다. 각 실험군 간의 통계적 유의성은 one-way ANOVA로 하였으며, 사후분석은 Duncan's multiple comparison test를 시행하였다.
Ⅲ. 實驗結果
- 1. 세포 독성
LR 에탄올 및 열수 추출물의 Raw 264.7 세포에 대한 세포 독성 실험에서 에탄올 추출물 20㎍/㎖의 농도에서 80%, 에탄올 추출물 50 ㎍/㎖, 열수 추출물 20, 50 ㎍/㎖의 농도에서 70%, 에탄올 및 열수 추출물 100 ㎍/㎖의 농도에서 60%의 세포 생존율을 나타냈다( Table 1 ).
- 2. NO 생성 저해능
LR 에탄올 및 열수 추출물의 LPS로 유도된 Raw 264.7 세포에 대한 NO 생성 저해능 실험에서 100 ㎍/㎖ 농도의 에탄올 추출물에서 열수 추출물에 비해 의미있는 NO 생성 저해능을 보였다( Table 2 ).
- 3. DPPH 라디컬 소거능
LR 에탄올 및 열수 추출물로 처리한 HaCaT 세포에 대한 DPPH 라디컬 소거능 실험에서 에탄올 및 열수 추출 모두에서 의미있는 소거능을 보이지 않았다( Table 3 ).
- 4. 항균 효능 평가
LR의 여드름 유발균인 Propionibacterium acnes 에 대한 항균 효능을 평가하기 위해 paper disk diffusion의 방법을 사용하여 Inhibition zone의 직경을 측정한 결과 LR은 항균 효능이 나타나지 않았다( Fig.1 ).
Ⅳ. 考 察
외용약은 외치법에 의해 시술되는 것으로 국소적 혹은 전신적 치료를 목적으로 신체 외부에 직접 이용되는 약물로 본초를 적당하게 가공 제약하여 체외에 敷, ?, 擦, 吹, 点, 熏, 洗 등의 방법으로 각종 질병을 치료하거나 예방하고자 사용되며, 水, 酒, 蜜, 醋 등과 상온에서 혼합하거나 또는 가온하면서 혼합하여 국부에 적용하는 치료법이다 2 , 15) .
沐藥法을 활용하기 위해 사용되는 혼합 용매는 질병의 성질에 따라 아주 다양하여, 가장 무난하게는 水를, 散瘀解毒에 醋를, 助行藥力에 酒를, 辛香散邪에 蔥·薑·?·蒜汁을, 淸凉解毒에 菊花·絲瓜葉汁 및 銀花露를, 緩和刺戟에 鷄子淸을, 潤澤肌膚에 油를 사용한다. 또는 陽證에 菊花汁·銀花露를, 半陰半陽에 蔥·薑·?汁 및 蜂蜜을, 陰證에 醋·酒를 사용한다 2 , 16) . 이처럼 沐藥法을 활용함에 있어 혼합 용매는 다양하게 이용되어 왔다 2) .
외용약을 이용한 여드름 치료와 관련된 연구 논문들을 살펴보면 서로 다른 외용약을 여드름 환부에 직접 도포한 임상적 논문 17 , 18) , 여드름에 활용되는 서로 다른 외용약의 염증과 관련된 기전을 연구한 실험적 논문 19 - 21) , 외용약을 중심으로 이전에 발표한 연구들을 review한 논문 22) 이 있었다. 이 논문들은 모두 여드름에 활용될 수 있는 본초 및 방제에 대한 연구들로 혼합 용매에 따른 추출의 차이에 대한 연구는 이루어지지 않았다 2) .
이에 동일 약제라 하여도 추출용매에 따라 추출성분과 효능의 정도가 달라 질 수 있음을 고려하여 粉刺에 외용 치료제로 沐藥法을 이용하여 활용되는 藁本을 에탄올과 물로 각각 추출하여 세포독성, NO 생성 저해능, DPPH 소거능, 항균 효능을 비교하여 추출용매에 따른 차이를 알아보고자 하였다.
염증과 관련된 실험에 앞서 藁本 에탄올 및 열수 추출물의 Raw 264.7 세포에 대한 세포 독성 실험에서 에탄올 추출물 20㎍/㎖의 농도에서 80%, 에탄올 추출물 50 ㎍/㎖, 열수 추출물 20, 50 ㎍/㎖의 농도에서 70%, 에탄올 및 열수 추출물 100 ㎍/㎖의 농도에서 60%의 세포 생존율을 나타냈다( Table 1 ).
염증반응은 세포손상을 일으키는 자극이나 손상인자를 제거하거나 희석을 위한 생체 방어로서, 혈관을 가진 결합조직에서 볼 수 있는 복합적 반응으로 많은 화학적 물질에 의하여 매개된다 2 , 23) . LPS, cytokine 및 bacterial toxin 같은 세포손상을 일으키는 자극이나 손상인자들에 의해 iNOS의 발현이 증가하게 되며, iNOS는 L-arginine을 L-citrulline으로 전환시키면서 반응성이 강한 자유라디칼인 NO를 생성하고 과량의 NO는 염증반응을 매개한다 2) .
藁本 에탄올 및 열수 추출물의 LPS로 유도된 Raw 264.7 세포에 대한 NO 생성 저해능 실험에서 100 ㎍/㎖ 농도의 에탄올 추출물에서 열수 추출에 비해 의미있는 NO 생성 저해능을 보여( Table 3 ), 결과적으로 염증 억제를 위해서는 藁本 에탄올 추출물을 활용하는 것이 보다 효과적일 것이라 사료된다.
활성산소란 산소가 가지는 화학적 특성으로 인하여 생성되는 free radical 및 이로부터 유래된 산소화합물로 높은 반응성을 바탕으로 생체 내에서 DNA나 세포막 등에 작용하여 산화적 손상을 일으킨다고 보고 되고 있다 24) . 그러나 활성산소는 면역활동 등 생명에 필수적인 역할을 하며, 각종 염증반응에 있어서도 관여 되므로 항염과 함께 항산화에 대한 효능을 살펴보는 것은 염증성 질환에 응용할 수 있는 韓藥을 연구하는데 필수적이라 할 수 있다 25) . DPPH는 안정한 유리기로 cysteine, glutathione과 같은 아미노산과 ascorbic acid, aromatic amine 등에 환원되어 탈색되므로 항산화물질의 항산화능을 측정할 수 있다.
藁本 에탄올 및 열수 추출물로 처리한 HaCaT 세포에 대한 DPPH 라디컬 소거능 실험에서는 의미 있는 소거능을 보이지 않아, 항산화 효과는 미미할 것으로 것으로 사료된다.
Propionibacterium acnes 는 혐기성 그람양성균으로 여드름 유발균으로 알려져 있으며 피지가 없이는 거의 발육할 수 없는 호지성균이다. 따라서 P. acnes의 증식은 피지가 많은 부위에 한정되어 있으며 지방분해효소와 화학주성인자를 분비하여 피지를 triglyceride와 유리 지방산으로 가수분해하고 유리 지방산은 모낭벽을 파괴하여 모낭 내용물이 진피내로 유출되면서 염증반응이 일어나게 된다. 따라서 여드름을 억제시키고 치료하기 위해서는 피지 생성과 염증반응을 억제시키는 노력과 함께 P. acnes의 증식을 억제시키는 것이 필요하다 26) .
藁本 에탄올 및 열수 추출물로Propionibacterium acnes에 대한 항균 효능을 평가하기 위해 paper disk diffusion의 방법을 사용하여 항균 효능을 측정하였으나 항균 효능은 전혀 나타나지 않았다( Fig. 1 ).
전체적으로 藁本을 외용 치료제로 사용하여 粉刺에 효과적으로 활용하기 위해서는 에탄올 추출을 하는 것이 염증 억제를 높일 수 있는 방법이라 사료된다.
Ⅴ. 結 論
藁本의 에탄올 및 열수 추출에 따른 항염과 항산화능을 살펴본 결과는 다음과 같다.
1. 藁本의 에탄올 추출물 20 ㎕/㎎에서 80%, 에탄올 추출물 50 ㎕/㎎, 열수 추출물 20, 50 ㎕/㎎에서 70%, 에탄올 추출물 및 열수 추출물 100 ㎕/㎎에서 60%의 세포 생존율을 보였다.
2. 藁本의 에탄올 추출물 100 ㎕/㎎에서 열수 추출물보다 의미 있는 NO 생성 저해능을 보였다.
3. 藁本의 에탄올 및 열수 추출물 모두 의미 있는 DPPH 라디컬 소거능을 보이지 않았다.
4. 藁本의 에탄올 및 열수 추출물 모두 Propionibactrium acnes 에 대해 항균성이 나타나지 않았다.
이상의 결과를 종합해 보면 藁本의 粉刺에 대한 외용적 활용은 에탄올 추출물이 효과적일 것 으로 사료된다.
The Cell Viability of Ligustici Rhizoma Extract on Macrophage Raw 264.7 Cells by MTT AssayStatistical significances were tested by oneway ANOVA among groups.D: The same letters indicate non-significant difference between groups based on Duncan's multiple comparison test.LR : Ligustici RhizomaEx : extract
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The Cell Viability of Ligustici Rhizoma Extract on Macrophage Raw 264.7 Cells by MTT Assay Statistical significances were tested by oneway ANOVA among groups. D: The same letters indicate non-significant difference between groups based on Duncan's multiple comparison test. LR : Ligustici Rhizoma Ex : extract
Inhibitory Efficacy of Ligustici Rhizoma on NO Production in LPS-induced Macrophage Raw 264.7 CellStatistical significances were tested by oneway ANOVA among groups.D: The same letters indicate non-significant difference between groups based on Duncan's multiple comparison test.NMMA: NG-methyl-L-arginineacetatesaltLR : Ligustici RhizomaEx : extract
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Inhibitory Efficacy of Ligustici Rhizoma on NO Production in LPS-induced Macrophage Raw 264.7 Cell Statistical significances were tested by oneway ANOVA among groups. D: The same letters indicate non-significant difference between groups based on Duncan's multiple comparison test. NMMA: NG-methyl-L-arginineacetatesalt LR : Ligustici Rhizoma Ex : extract
The Scavenging Efficacy of Ligustici Rhizoma on DPPH Radical in HaCaT CellStatistical significances were tested by oneway ANOVA among groups.D: The same letters indicate non-significant difference between groups based on Duncan's multiple comparison test.ns : non-significantLR : Ligustici RhizomaEx : extract
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The Scavenging Efficacy of Ligustici Rhizoma on DPPH Radical in HaCaT Cell Statistical significances were tested by oneway ANOVA among groups. D: The same letters indicate non-significant difference between groups based on Duncan's multiple comparison test. ns : non-significant LR : Ligustici Rhizoma Ex : extract
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The Effects of Ligustici Rhizoma on Inhibition Zone Diameters for Propionibactrium acnes. LRE 20 : 20 ㎎/㎖ Ligustici Rhizoma extracted with ethanol LRW 20 : 20 ㎎/㎖ Ligustici Rhizoma extracted with water
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