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Study of four weeks repeated-dose toxic test of Sweet Bee Venom in rats
Study of four weeks repeated-dose toxic test of Sweet Bee Venom in rats
Journal of Pharmacopuncture. 2011. Jan, 14(1): 5-24
Copyright ©2011, KOREAN PHARMACOPUNCTURE INSTITUTE
  • Received : February 18, 2011
  • Accepted : February 25, 2011
  • Published : January 30, 2011
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About the Authors
Hae-Yon Kwon

Abstract
Objectives:
This study was performed to analyse four weeks repeated -dose toxicity of Sweet Bee Venom (SBV-pure melittin, the major component of honey bee venom) in rats.
Methods:
All experiments were conducted under the regulations of Good Laboratory Practice (GLP)at Biotoxtech Company, a non-clinical study authorized institution. Male and female rats of 5 weeks old were chosen for the pilot study of four weeks repeated-dose toxicity and was injected at the level of 0.56 mg/kg body weight (eighty times higher than the clinical application dosage as the high dosage), followed by 0.28 and 0.14 mg/kg as midium and low dosage, respectively. Equal amount of normal saline was injected as the control group every day for four weeks.
Results:
1. No mortality was witnessed in all of the experiment groups. 2. All experiment groups appealed pain sense in the treating time compared to the control group, and side effects such as hyperemia and movement disorder were observed around the area of injection in all experiment groups, and the higher dosage in treatment, the higher occurrence in side effects. 3. Concerning weight measurement, neither male nor female groups showed significant changes compared to the control group. 4. Concerning to the CBC and biochemistry, all experiment groups didn't show any significant changes compared to the control group. 5. Concerning weight measurement of organs, experiment groups didn't show any significant changes compared to the control group. 6. To verify abnormalities of organs and tissues, those such as cerebellum, cerebrum, liver, lung, kidney,and spinal cords were removed and we conducted histologocal observation with H-E staining.Concerning the histologocal observation of liver tissues, some fatty changes were observed around portal vein in 0.56 mg/kg experiment group. But another organs were not detected in any abnormalities. 7. The proper high dosage of SBV for the thirteen weeks repeated test in rats may be 0.28 mg/kg in one time.
Conclusion:
Above findings suggest that SBV is relatively safe treatment medium. Further studies on the subject should be conducted to yield more concrete evidences.
Keywords
I. 서론
어떤 물질에 대한 독성을 평가하기 위해서는 그 물질이 일으킬 수 있는 급성 또는 만성적인 유해 작용과 이들 유해 작용 각각의 용량-반응관계를 확인해야 하는데 이러한 정보를 얻는데 가장 중요한 것이 바로 동물을 이용한 시험성적이다 1) . 즉, 독성실험은 의약품 등의 안전성 평가를 위한 중요한 기초자료이며, 필수적이라 할 수 있다. 독성연구의 주요목적은 신약의 안전성을 평가하여 임상적 용약의 안전을 확보하기 위해 시행하는 것이다 2) .
이 중 4주 반복 독성실험은 아급성 독성실험으로, mouse와 rat와 같은 설치류와 개, 원숭이 등의 비설치류에 대한 독성실험 결과가 요구되며 3) 시험물질의 독성에 대한 반응의 심각성 검토와 만성독성실험을 위한 적정 용량의 설정하는데 그 의미가 있다.
약침요법은 침구요법과 약물요법을 결합한 신침요법의 일종으로 우리나라에서 독자적으로 개발된 독특한 한방치료기술 중의 하나이다 4) . 이미 많은 한의사들이 임상에서 광범위하게 사용하고 있으며 특히 봉약침은 살아 있는 꿀벌 (Apis melifera) 의 독낭에 들어있는 독을 인위적으로 추출ㆍ정제하여 질병의 치료에 이용하는 방법으로 자연계의 독을 약침으로 사용하는 최초의 의료기술이다.
벌의 독은 진통, 소염, 5 - 6) 항암 7) 효과 등이 있어 퇴행성 관절염 8 - 10) 이나 류마티스 관절염 11 - 12) , 추간판 탈출증 13 - 15) , 편타 손상 등 16 - 17) 에 유효한 것으로 알려져 있다. 하지만 시술 후에 나타나는 알레르기 반응과 벌의 독에 과민한 체질에서 발생하는 전신 알레르기 반응(anaphylactic shock) 등의 문제로 인해 대중화에 어려움을 겪고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 개발된 것이 Sweet Bee Venom(특허 제 10-0744755, 이하 Sweet BV)이다 18) . Sweet BV는 건조 봉독에서 약 40-50%를 차지하는 분자량 2840의 melittin을 주성분으로 19) 하며, gel filtration이라는 단백질 분리기법을 이용하여 얻을 수 있다 18) . 이미 melittin은 소염, 진통, 항암 효과 등이 있음이 많은 연구보고 20 - 21) 를 통하여 알려져 있으며, 김 등 22) 이 “Sweet BV의 rat에 대한 단회 근육시술 독성시험” 과 박 등 23) 의 “비글견을 이용한 4주반복 근육시술 독성시험” 윤 등 24) 의 “비글견을 이용한 단회독성 근육시술 독성시험”, 그리고 임 등 25) 의 “Sweet BV가 비글견의 심혈관계에 미치는 영향”을 보고한 연속 연구의 일환으로 저자는 식품의약품 안전청의 독성시험기준 3) 에 근거하여 설치류인 rat를 대상으로 Sweet BV의 4주 반복 독성을 평가하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
Ⅱ. 재료 및 방법
- 1. Sweet BV의 조제
동결 건조된 분말형태의 Sweet BV를 전자저울(LA230S, CP323S, Sartorius, Germany)로 측량하여 조제병에 넣고, 부형제(Normal Saline)를 일부 넣어 vortex mixer로 용해시킨 후, 실험에 필요한 농도로 만들어 사용하였다. 실험에 사용한 Sweet BV는 시술 당일에 조제하여 사용하였다.
- 2. 실험동물
- 2.1 실험동물 및 사육 환경
실험에 사용된 동물은 5 주령된 암·수 rat로 각각 24마리씩 입수하여 사용하였다. 입수 시 수컷의 체중은 121.7∼137.6 g이었고, 암컷은 111.9∼125.3 g이었다. 입수 후 1 주일간의 검역·순화 기간 중 매일 1회씩 일반증상을 관찰하였고, 주 1회 체중을 측정하였으며 검역기간 종료 후에도 건강상태를 확인하였다. 실험실의 온도는 20.3∼23.6 °C, 습도는 40.5∼58.5%를 유지하였고, 실험동물용 고형사료(Teklad Certified Irradiated Global 18% Protein Rodent Diet 2918C)와 물은 충분히 공급하였다. 모든 실험은 식품의약품안전청고시 제2005-79호(비임상시험 관리기준)의 Good Laboratory Practice (이하 GLP) 규정 26) 을 준수하여 비임상시험 인증기관인 (주)바이오톡스텍에서 시행하였다.
- 2.2 군의 분리
군 분리는 검역·순화 기간 종료 후 체중을 기초로 하여 암·수 각각 대조군 5마리, Sweet BV 시술군(저, 중, 고용량군) 5마리씩 분리하였다.
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- 2.3 1회 시술 용량의 설정 및 시술
Sweet BV의 임상적용 예정용량인 약 0.1∼0.4 ㎎/1회 (성인 60 kg 기준시 최대 0.007 ㎎/㎏)인 것을 참조하여 임상적용 예정용량의 약 80배인 0.56 ㎎/㎏을 고용량으로 설정하고, 0.14 및 0.28 ㎎/㎏을 저용량 및 중간 용량으로 설정하였다. 대조군에는 Sweet BV 시술군과 동일한 액량의 부형제(normal saline)를 시술하였다. 시술 부위는 모든 실험군의 좌측과 우측 대퇴부에 가급적 같은 부위의 중복을 피하면서 4주간 매일 1회씩 시술하였다.
- 3. 관찰 및 검사
- 3.1 일반증상 관찰
관찰 기간 중 1일 1회 이상 일반 상태, 운동성, 자율신경계의 기능 및 배설물 등에 대한 증상을 관찰하였다. 1일 2회 빈사나 사망동물의 유무를 확인하였으며, 최종 시술 후 14일까지 매일 1회 일반증상을 관찰하였다.
- 3.2 체중측정 및 사료섭취량
체중은 시술당일(시술 전), 시술 후 주 1회 측정하였으며, 상대 장기중량을 측정하기 위해 부검 시에는 절식체중을 측정하였다. 사료섭취량은 측정일의 전날에 공급한 사료와 동일한 시간대에 잔량을 측정하여 섭취량을 산출하였다.
- 3.3 혈액학적 검사(CBC)
모든 동물에 대하여 시술 전 및 시술 4주 후 약 16시간 절식시킨 후 요측피정맥으로부터 약 3 ㎖의 혈액을 채취한 후 EDTA가 함유된 CBC bottle에 보관한 후 혈구분석기(ADVIA 120, SIMENS, Germany)로 RBC, HGB, hematocrit, RBC indices(MCV, MCH, MCHC), WBC, platelet count, 그리고 reticulocytes 등을 분석하였고, 혈액과 3.2 % sodium citrate을 9 : 1의 비율로 섞어 3,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 혈장을 분리한 후, 응고시간 분석기(ACL 7,000, Instrumentation Laboratory, USA)를 이용하여 prothrombin time, activated partial thromboplastin time 등을 관찰하였다.
- 3.4 혈액생화학적 검사(Biochemistry)
혈액학적 검사와 동일한 시간에 약 3 ㎖의 혈액을 채취한 후 3,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 혈장을 분리하였다. 분리한 혈장은 혈액생화학분석기(7080, HITACHI, Japan) 및 전기영동 분석기(Epalyzer2, HELENA, Japan)를 이용하여 AST, ALT, ALP, creatinine, total bilirubin, total protein, albumin, globulin, A/G ratio, total cholesterol, glucose, triglycerides, phosphorus, 그리고 calcium 등을 분석하였다.
- 3.5 부검
관찰기간 종료 후, 모든 개체는 마취 하(Lot No.: HAQ8AV, thiopental sodium, 중외제약)에 방혈하여 안락사 시킨 후 체표 및 전신의 조직에 대하여 상세한 육안 검사를 시행하였다.
- 3.6 장기 중량 측정
부검 시 개체별로 뇌, 심장, 간, 비장, 신장, 갑상선, 부신, 난소 그리고 고환 등의 장기들을 적출하여 습 중량을 측정하였고, 체중에 대한 상대 장기중량을 산출하였다. 좌우가 있는 장기들은 합하여 무게를 측정하였다.
- 3.7 조직병리학적 검사
부검 시 개체별로 실시한 대조군 및 실험군의 모든 동물에 대하여 뇌, 뇌하수체, 갑상선 및 부갑상선, 흉선, 폐 및 기관지, 심장, 간 및 담낭, 비장, 신장, 부신, 악하선(mandibular gland), 하악림프절(mandibular lymph node), 위, 공장(jejunum), 결장(colon), 맹장, 고환, 부고환(epididymis), 전립선, 자궁, 대퇴골, 췌장, 난소, 방광, 안구 및 시신경, 척수 및 투여 부위 등의 조직을 적출하여 육안적인 이상을 관찰하였고, 특별한 이상이 발견되지 않을 경우 소뇌, 대뇌, 간, 폐, 신장, 그리고 척수신경만 10% 중성완충 포르말린용액 (neutral buffered formalin)에 고정하였다.
고정한 조직은 삭정, 탈수 및 파라핀 포매 등의 일반적인 조직처리과정을 거쳐 조직절편을 제작하여 박절한 후, Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 실시하였다. 골조직의 탈회는 Calci-Clear-Rapid TM 액(National diagnostics, USA)으로 실시하였다.
- 4. 통계처리
실험에서 얻어진 체중, 사료섭취량, 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사, 장기중량 결과는 SAS(version 9.1.3, SAS Institute Inc., U.S.A.)를 사용하여 검정하였고 Bartlett test를 실시하여 등분산성을 검정하였다 (p≺0.05). 등분산인 경우, One-way analysis of variance (ANOVA)를 실시하여 유의성(p≺0.05)이 관찰되면 Dunnett's t-test의 다중검정을 실시하였다(p≺0.05, p≺0.01).
Ⅲ. 결과
- 1. 일반증상 관찰
실험기간 동안 암·수 모든 실험군에서 사망 개체는 관찰되지 않았다. 보행이상(abnormal gait)과 좌측 또는 우측 시술부위에서 충혈 (hyperemia)이 산발적으로 관찰되었고, 용량 의존적으로 발생빈도가 관찰되었다. 수컷 0.56 ㎎/㎏ 시술군에서 좌측 후지 발가락에 경련이 (convulsion)이 시술 16일에 1마리에서 관찰되었으나 오래 지속되지는 않았다( Table . 1 , Appendix 2).
- 2. 체중변화 및 사료섭취량
관찰기간 동안 실험군에서 암·수 모두 대조군과의 유의한 체중변화나 사료섭취량의 차이는 관찰되지 않았다( 1 - 2 2 - 3 Appendix 3-4).
- 3. 혈액학적 검사(CBC)
수컷 실험군에서는 대조군과 비교시 모든 검사항목에서 차이는 없었다. 암컷 0.14 ㎎/㎏ 시술군에서 대조군과 비교시 헤마토크리트치 (HCT)가, 0.14 및 0.28 ㎎/㎏ 시술군에서 혈색소량 (HGB)이 유의성 있게 감소하였으나, 모두 경미한 변동으로서 용량의존성이 없어 독성학적 의미는 없다.
고용량인 0.56 ㎎/㎏ 시술군에서 혈소판수(PLT)가 유의하게 증가한 소견이 나타났으나, 생물학적 변동범위(801∼1908 ×103cells/µL)내에서의 경미한 변동에 해당되었고, 독성학적으로 주목할 만한 자료는 아닌 것으로 판단되었다. 혈액학적 검사에서는 실험군 모두 대조군에 비하여 Sweet BV 시술로 추정할만한 이상 변화는 관찰되지 않았다( Table 4 .).
- 4. 혈액생화학검사(Biochemistry)
수컷 0.28 및 0.56 ㎎/㎏ 시술군에서 대조군과 비교시 AST가 용량의존성으로 유의성 있는 증가가 인정되었다. 암컷 시술군에서는 대조군과 비교시 모든 검사항목에서 유의한 차이를 나타내지 않았다. 그 외의 혈액생화학검사에서는 실험군 모두 대조군에 비하여 Sweet BV의 시술로 추정할만한 이상 변화는 관찰되지 않았다( Table . 5 , Appendix 6).
- 5. 장기 중량 측정
절대 및 상대적인 장기 중량 검사에서 실험군 모두 대조군에 비하여 Sweet BV 시술로 인한 중량의 이상변화가 관찰되지 않았다( 6 - 7 ., Appendix 7, 8).
- 6. 부검 및 조직병리학적 검사
부검결과, 암·수 Sweet BV 시술군에서 Sweet BV의 시술로 기인한 영향으로 판단될만한 소견은 관찰되지 않았다. 단지 암컷 0.14 ㎎/㎏ 시술군에서 비장의 팽윤면(spleen, raised)이 단 1례에서 관찰되었으나 0.28 및 0.56 ㎎/㎏ 시술군에서 동일한 변화가 관찰되지 않았으므로, 우발적인 분포에 의한 변화로 Sweet BV 투여와는 관련성이 없는, 개체의 특이성으로 추정되었다( Table 8 .).
H&E 염색을 실시하여 조직병리학적 검사 결과, 암·수 0.56 ㎎/㎏ 시술군에서 문맥중심성의 간세포의 지방변성(degeneration, hepatocyte, fatty, periportal)이 관찰되었다. 변화가 관찰된 간세포는 세포질 내 지방방울(lipid droplet)로 추정되는 투명한 공포를 포함하고 있었으며, 이러한 간세포는 90%이상의 문맥주변에서 공통적으로 관찰되었다( Fig.4 ).
그 외, 수컷 대조군의 신장 바깥속질(outer medulla)에서 경도의 국소성의 유리질원주(cast, hyaline, focal, mild)가 1례 관찰되었으나, 대조군에서 관찰된 소견이었으므로 독성학적 의미는 없었다.
암컷 대조군과 실험군 0.14 및 0.28 ㎎/㎏ 시술군에서 간세포의 지방변성이 각각 1례씩 관찰되었으나, 국소성으로서 특정 위치에 분포하지 않았으며, 대조군에서도 관찰되었으므로 우발적인 분포로 판단하였다( Table . 9 , Appendix 9-10).
그 외 소뇌, 대뇌, 폐, 신장 및 척수신경 등 다른 장기에서는 특별한 이상 소견이 관찰되지 않았다( Fig. 2 - 6 ).
Ⅳ. 고찰
약침요법은 침구요법과 약물요법을 결합한 신침요법의 일종이다. 침구요법은 經絡論을, 약침요법은 氣味論을 바탕으로 하므로 약침요법은 經絡論과 氣味論을 근간으로 한다. 시술과정에서 주사기를 사용하나 치료 약물의 선정은 氣味論, 치료 부위의 선정은 經絡論을 위주로 하므로 약침요법은 과학기술 및 의료기기의 발달로 탄생한 한국 한의학의 독특한 치료기술이라고 할 수 있다 4) .
약침요법의 하나인 봉약침요법은 살아 있는 꿀벌(Apis melifera)의 독낭에 들어있는 독을 인위적으로 추출 · 정제하여 질병과 유관한 부위 및 경혈에 주입함으로써 자침의 효과와 벌의 독이 지니고 있는 생화학적인 약리작용을 질병의 치료에 이용하는 新鍼療法으로, 자연계에 존재하는 동물성 독을 치료에 이용하는 “以毒治病” 의 침구치료를 구현한 새로운 치료기술이다. 毒(poison, toxin, toxicant)이란 “여러 가지 경로를 통해서 소량이 체내로 들어오면, 생체조직에 기능적 혹은 형태적으로 장애를 주거나 혹은 치사작용을 일으키는 물질 2) ”로 정의하고 있는 것처럼 봉약침도 벌의 독을 치료에 이용하므로 소량의 사용으로도 환자에게 심각한 부작용을 야기할 수 있다 4) .
한의학에서도 약재에 대하여 有毒, 無毒 등의 표현으로 독성을 분류하여 임상에 사용하고 있고, 본초학의 고서인 神農本草經에서도 독성의 强弱에 따라 上藥, 中藥, 下藥의 세 가지로 나누어 上藥은 거의 無毒하면서 장기간 복용하여 輕身益氣, 不老延年 등의 효능이 있는 약으로, 中藥은 약간의 독성을 지니면서 질병의 예방과 치료에 사용되는 약으로, 그리고 下藥은 독성이 강하여 장기간의 복용이 곤란하면서 질병을 치료하는 효과가 강한 약으로 구분하고 있다 27) .
어떤 물질에 대한 독성을 평가하기 위해서는 그 물질이 일으킬 수 있는 급성 또는 만성적인 유해 작용과 이들 유해 작용 각각의 용량-반응 관계를 확인해야 하는데 이러한 정보를 얻는데 가장 중요한 것이 바로 동물을 이용한 시험성적이다. 즉, 독성실험은 의약품 등의 Sweet BV 안전성 평가를 하기 위하여 중요한 기초자료이며, 필수적이라 할 수 있다 3) .
독성연구의 주요목적은 신약의 안정성을 평가하여 임상적 용약의 안전을 확보하기 위해 시행하는 것으로, 독성실험은 크게 급성 독성실험(단회 투여 독성시험), 아급성 독성실험(4주 반복투여 독성시험), 그리고 만성독성실험(3개월 이상 반복투여 독성시험)으로 나눈다 2) .
일반적으로 화학적 물질의 독성 반응은 물질의 물리-화학적 특성이나 노출경로, 생체 또는 사람의 감수성(susceptibility)에 따라 다양한 결과를 나타낼 수 있으므로 독성의 측정은 다방면에서 실시되어야 한다. 특이적 화학물질의 노출 상태에 따라 독성에 영향을 미치는 주요 인자는 투여경로, 시간, 빈도 등이 있다. 노출 경로는 독성 발현에 큰 변화를 나타내는데 생체 내에 노출되는 경로에 따라 정맥 내 ≻ 흡입 ≻ 복강 주사(i.p) ≻ 피하주사(s.c) ≻ 근육주사(i.m) ≻ 내피(경피) ≻경구 ≻ 국소(topical)의 순으로 빠르고 강하게 나타나는 경향이 있다.
노출 기간과 빈도도 독성에 영향을 미치는 중요한 인자이고, 동물학자들은 동물의 노출을 급성, 아급성, 아만성, 만성의 4가지 범주로 나눈다. 급성은 24시간 내의 노출을, 아급성은 1개월 또는 1개월 이내의 노출을, 아만성은 1-3개월 간, 만성 노출은 3개월 이상을 말한다. 노출의 방법도 독의 작용에 차이를 가져올 수 있는데, 이에 따라 4주 반복 투여, 혹은 3개월 반복 투여 등으로 나누어 평가한다 3) .
화학물질의 원치 않는 독성효과에 대한 기준을 마련하기 위하여 우리나라에서도 이미 오랜 기간 독성의 성적 수집을 촉진시키는 일련의 시험계획지침서(testing protocol guideline)와 급 · 만성 도는 특수 독성 시험에 관한 지침이 공포되어 적용되고 있다.
식품의약품 안전청에서도 독성시험기준 2) 을 엄격하게 제안하고 있고, 이러한 시험은 모두 GLP 규정에 의해 평가되어야 인정을 받을 수 있다 26) . 또한 의약품의 품목 허가 신고 · 심사 규정 2) 에서도 의약품의 안전성ㆍ유효성 심사를 위하여 제출해야 하는 자료로 첫째, 기원 및 발견의 경위(배합목적 및 용도에 관한 자료 포함), 둘째, 물리화학적 성질, 규격에 관한 자료, 셋째, 안정성에 관한 자료, 넷째, 독성에 관한 자료(보존제 및 타르색소의 경우에는 신약의 첨부자료에 준하며 그 외에는 4주 반복 투여독성, 반복투여독성, 기타 필요한 독성시험자료)를 제출해야 한다고 규정하고 있다. 이 중 4주 반복 투여 독성실험은 아급성 독성실험에 해당되며, 시료의 독성에 대한 반응의 심각성 검토와 만성독성실험을 위한 적정 용량의 설정을 위해 시행된다.
봉약침의 원료인 봉독은 크게 효소, 펩티드, 저분자 유기물질로 구성되어 있고 현재까지 약 40여개의 물질이 보고되고 있다 19) .
그동안의 연구 보고에 의하면 봉약침은 진통 소염효과 5 - 6) 가 있고, 면역계에 작용하며 11 - 12 , 20 - 21) 이미 많은 임상 보고를 통하여 퇴행성 슬관절염 8 - 9) 이나 고관절염 10) , 류마티스 관절염 11 - 12) , 요추간판 탈출증 13 - 15) , 중풍 후유증 16 - 17) 등의 질환이나 다발성 경화증 28) , 근위축성 측삭경화증 29) , 그리고 근이영양증 30) 과 같은 난치성 질환에도 유의한 치료효과가 있음이 보고되고 있다.
그러나 대부분의 독과 같이 벌의 독에 노출되었을 때도 과민한 면역반응이 나타날 수 있고, 특히 치명적인 아낙필락시 반응은 봉약침의 임상 사용에 중요한 걸림돌이 되고 있어 31 - 33) 이러한 문제를 개선하고자 봉약침의 항원역할을 하는 효소인 phospholipase A 2 (이하 PLA2)나 hyaluronidase 등의 고분자 물질과 histamine 등의 저분자 물질을 함께 제거하고, 벌의 독에서 가장 주된 성분인 melittin을 주성분으로 분리 정제한 Sweet BV가 개발되었고 18 , 34) , 선행 연구를 통하여 봉약침에 의한 아나필락시 반응의 위험과 국소 알레르기 반응을 낮출 수 있음이 보고 35 - 36) 된 바 있다.
Melittin은 26개의 아미노산으로 구성된 peptide로 벌의 독에서 건조 중량 40-50%를 차지하는 분자량 2840의 수용성 물질이다 37) . Melittin은 벌의 독에서 가장 중요한 allergen인 PLA2를 활성화시키고 세포막에 구멍을 뚫어 파괴시키는 작용이 있는 것으로 알려져 있는데 이러한 작용은 melittin의 구조와 관련이 있는 것으로 알려져 있다 38) . 각각의 사슬은 두 개의 나선구조로 되어 있고, 모두 휘어진 막대기 모양을 하고 있다. 이러한 구조는 세포의 용해 작용이 용이하고, 따라서 melittin이 암세포의 사멸이나 소염효과를 나타내는 것과 밀접한 관련이 있는 것으로 추정된다.
이미 이전의 보고 21 , 38) 에서 melittin은 nuclear factor-κB(이하 NF-κB)의 활성을 조절하여 lipopolysaccharide(LPS), tumor necrosis factor-α(TNF-α), 그리고 sodium nitroprusside(SNP)의 활성을 저해하여 염증의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다.
NF-κB는 면역과 염증에 관여하는 많은 유전자들을 조절하는 인자이며 세포자멸사를 억제하는 것으로 알려져 있다 37) . NF-κB군에는 NF-κB1(p50), NF-κB2(p52), Rel 단백인 RelA(p65), RelB, c-Rel 등이 있는데 NF-κB p50은 암세포의 발현에서 가장 빈번하게 발현되는 단백으로 특히 대장, 직장암의 발생과정에서 증가하는 것으로 알려져 있으며 38) 암의 진행에 중요하게 작용하는 단백질이다. Melittin은 NF-κB p50의 활성을 저해하고 이를 통해 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환을 억제하는 것으로 보고되고 있다 39) .
이에 저자는 이전의 결과 22 - 24) 를 바탕으로 Sweet BV의 4주 반복 독성을 알아보기 위해 Sweet BV의 임상적용 예정용량인 약 0.1∼0.4 ㎎/human/회 (성인 60 kg 기준시 최대 0.007 ㎎/㎏)을 참조하여 임상적용 예정용량의 약 80배인 0.56 ㎎/㎏을 고용량으로 설정하고, 0.14 및 0.28 ㎎/㎏을 저용량 및 중간 용량으로 설정한 후 설치류인 rat를 대상으로 4주간 반복적으로 대퇴부의 근육부위에 매일 1회씩 시술하여 나타나는 독성반응을 관찰하고자 하였다.
그 결과 일반증상 관찰에서 실험기간 동안 모든 실험군에서 사망 개체는 관찰되지 않았다. 그리고 용량에 상관없이 모든 실험군에서 Sweet BV 시술 후 순간적인 통증 반응을 나타내었다.
또한 모든 실험군에서 시술 부위에 종창이 발생하였는데, 경미하지만 용량 의존적인 경향을 나타내었다.
체중의 변화는 관찰기간 동안 실험군에서 암·수 모두 대조군과의 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 또한 사료섭취량에서도 실험군 모두 대조군과의 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
혈액학적 검사(CBC)에서 수컷 실험군에서는 모든 검사항목에서 대조군과 유의한 차이를 나타내지 않았으나 암컷 0.14 ㎎/㎏ 시술군에서 대조군과 비교시 hematocrit이, 0.14 및 0.28 ㎎/㎏ 시술군에서 hemoglobin이 유의하게 감소하였지만 모두 경미한 변동이고, 또한 용량의존성이 없어 독성학적 의미는 없다고 판단되었다.
고용량인 0.56 ㎎/㎏ 시술군에서 혈소판수(PLT)가 유의하게 증가한 소견이 나타났으나, 역시 생물학적 변동범위 내에서의 경미한 변동으로, 독성학적으로 주목할 만한 자료는 아닌 것으로 판단되었다. 다른 혈액학적 검사에서는 실험군 모두 대조군에 비하여 Sweet BV 시술로 추정할만한 이상 변화는 관찰되지 않았다.
혈액생화학검사에서는 수컷 0.28 및 0.56 ㎎/㎏ 시술군에서 대조군과 비교시 AST가 용량의존성으로 유의성 있는 증가가 인정되었다. 암컷 시술군에서는 대조군과 비교시 모든 검사항목에서 유의한 차이를 나타내지 않았다. 그 외의 검사 항목에서는 실험군 모두 대조군에 비하여 Sweet BV의 시술로 추정할만한 이상 변화는 관찰되지 않았다.
부검에서는 육안적 관찰에서 암·수 모든 실험군에서 Sweet BV 시술로 인한 이상 소견으로 보이는 것은 관찰되지 않았다.
조직병리학적 검사에서는 암·수 0.56 ㎎/㎏ 시술군에서 문맥중심성의 간세포의 지방변성이 관찰되었는데, 이전의 실험23)에서 진행한 beagle dog의 4주 반복 독성실험에서 동일한 용량의 시술에도 혈액학적 이상이 발견되지 않았던 점과 비교하여 볼 때 수컷 0.28 및 0.56 ㎎/㎏ 시술군에서 AST가 유의성 있는 증가를 나타낸 것은 설치류에 과량의 Sweet BV 시술이 간의 지방세포 생성에 영향을 미치는 것으로 추정되었다.
그 외에 약간의 이상소견이 대조군과 실험군에서 발견이 되었으나 대부분 자연발생적이거나 개체의 우발적인 이상조직으로 확인되었다. 그리고 뇌와 폐, 신장, 척수 등 다른 장기조직에서도 Sweet BV의 시술에 의한 장기나 조직의 이상 유무는 관찰되지 않았다.
이상의 연구 결과 Sweet BV는 과량 주입할 때에 간의 지방세포 축적에 영향을 줄 가능성이 제기되었고, 기타 장기나 조직에는 특별한 이상을 유발하지 않는 것으로 판단되었다. 또한 13주 반복 근육시술 독성실험에서는 장기간의 시술을 감안하여 본 실험에서의 1/2 용량인 0.07 및 0.14 ㎎/㎏을 저용량 및 중간 용량으로 설정하고 0.28 ㎎/㎏을 고용량으로 설정하는 것이 바람직할 것으로 판단되었다.
Ⅴ. 결론
본 연구는 벌의 독에서 추출한 Sweet BV(melittin)의 설치류(rat)에 대한 4주 반복 독성을 평가하고자 식품의약품안전청고시의 Good Laboratory Practice (GLP) 규정을 준수하여 시도하였다. 그 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
1. 모든 실험군에서 사망한 계체가 관찰되지 않았다.
2. 시술 후 일반증상의 관찰에서 시술 부위를 중심으로 용량의존적인 충혈, 부종, 그리고 일시적인 보행장애 등이 관찰되었다.
3. 체중의 변화와 사료의 섭취량을 측정한 결과 암·수 모두에서 대조군과 유의한 차이를 나타내지 않았다.
4. 혈액학적 검사, 혈액 생화학적 검사 등을 시행한 결과 실험군 모두에서 Sweet BV의 시술로 추정되는 이상 소견은 나타나지 않았다.
5. 장기의 중량 측정에서도 실험군 모두 대조군과 유의한 차이를 나타내지 않았다.
6. 장기와 조직의 조직학적 관찰을 시도한 결과 암·수 0.56 ㎎/㎏ 시술군에서 문맥중심성의 간세포의 지방변성이 관찰되었다. 기타 장기와 조직에는 이상 소견이 관찰되지 않았고 개체의 특이성이나 우발적인 병소 소견이 간헐적으로 관찰되었지만 Sweet BV의 시술로 추정될만한 변화는 없었다.
7. 13주 반복 근육시술 독성실험에서는 장기간의 시술을 감안하여 본 실험에서의 1/2 용량인 0.07 및 0.14 ㎎/㎏을 저용량 및 중간 용량으로 설정하고 0.28 ㎎/㎏을 고용량으로 설정하는 것이 바람직할 것으로 판단되었다.
이상의 연구 결과를 바탕으로 Sweet BV는 약침으로 임상에 사용하기에 비교적 안전한 치료제임을 알 수 있었다. 향후 이에 대한 보다 다양한 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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Body weight changes of male and female in dose escalating four weeks repeated intramuscular toxicity study of Sweet Bee Venom in rats.
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The tissue of cerebellum after 4 weeks repeated dose toxic test of Sweet Bee Venom(melittin-0.140.28 and 0.56 mg/kg) in SD rats.SD rats were treated one time a day with 0.56 mg/kg dose of Sweet Bee Venom during 4 weeks there were not detected in any abnormalities compared with control group in Hematoxylin & Eosin (H&E)staining(Χ 100) NAD: No abnormalities detected *:immediately after injection or approximately 10-30 mins
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The tissue of cerebrum after 4 weeks repeated dose toxic test of Sweet Bee Venom(melittin-0.14 0.28 and 0.56 mg/kg) in SD rats.SD rats were treated one time a day with 0.56 mg/kg dose of Sweet Bee Venom during 4 weeks there were not detected in any abnormalities compared with control group in Hematoxylin & Eosin (H&E)staining(Χ 100).
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The tissue of liver after 4 weeks repeated dose toxic test of Sweet Bee Venom (melittin-0.28(A&B) 0.56 mg/kg(C&D)) in SD rats.SD rats were treated one time a day with 0.14 0.28 and 0.56 mg/kg dose of Sweet Bee Venom during 4 weeks there were not detected in any abnormalities in 0.14 0.28 mg/kg experiment group(Χ 100) but 0.56mg/kg group showed hepatocyte fatty change around portal vein compared with control group in Hematoxylin & Eosin (H&E) staining(Χ 200).
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The tissue of lung after 4 weeks repeated dose toxic test of Sweet Bee Venom(melittin-0.14 0.28 and 0.56 mg/kg) in SD rats.SD rats were treated one time a day with 0.56 mg/kg dose of Sweet Bee Venom during 4 weeks there were not detected in any abnormalities compared with control group in Hematoxylin & Eosin (H&E)staining(Χ100). Significang difference from control by Dunnett's t-test: * p ≺0.05, ** p≺0.01.
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The tissue of spinal cord after 4 weeks repeated dose toxic test of Sweet Bee Venom(melittin-0.140.28 and 0.56 mg/kg) in SD rats.SD rats were treated one time a day with 0.56 mg/kgdose of Sweet Bee Venom during 4 weeks there were not detected in any abnormalities compared with control group in Hematoxylin & Eosin (H&E)staining(Χ100). Significant difference from control by Dunnett's t-test: ** p≺0.01
Clinical signs of 4-week repeated intramuscular does range finding study in SD rats (Group summary)NAD: No abnormalities detected*:immediately after injection or approximately 10-20 mins
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Clinical signs of 4-week repeated intramuscular does range finding study in SD rats (Group summary) NAD: No abnormalities detected *:immediately after injection or approximately 10-20 mins
(Continued)NAD: No abnormalities detected*:immediately after injection or approximately 10-30 mins
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(Continued) NAD: No abnormalities detected *:immediately after injection or approximately 10-30 mins
Body weights of 4-week repeated intramuscular dose range finding study in SD rats (Group summary)Grade- ±: minimal, +: mild
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Body weights of 4-week repeated intramuscular dose range finding study in SD rats (Group summary) Grade- ±: minimal, +: mild
Food consumptions of 4-week repeated intramuscular dose range finding study in SD rats (Group summary)
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Food consumptions of 4-week repeated intramuscular dose range finding study in SD rats (Group summary)
Hematological parameters of 4-week repeated intramuscular dose range finding study in SD rats (Group summary)Significang difference from control by Dunnett's t-test: * p ≺0.05, ** p≺0.01.
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Hematological parameters of 4-week repeated intramuscular dose range finding study in SD rats (Group summary) Significang difference from control by Dunnett's t-test: * p ≺0.05, ** p≺0.01.
Blood chemistry values of 4-week repeated intramuscular dose range finding study in SD rats (Group summary)Significant difference from control by Dunnett's t-test: ** p≺0.01
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Blood chemistry values of 4-week repeated intramuscular dose range finding study in SD rats (Group summary) Significant difference from control by Dunnett's t-test: ** p≺0.01
Absolute organ weights of 4-week repeated intramuscular dose range finding study in SD rats (Group summary)
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Absolute organ weights of 4-week repeated intramuscular dose range finding study in SD rats (Group summary)
Relative organ weights of 4-week repeated intramuscular dose range finding study in SD rats (Group summary)
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Relative organ weights of 4-week repeated intramuscular dose range finding study in SD rats (Group summary)
Histopathological findings of 4-week repeated intramuscular dose range finding study in SD rats(Group summary)External surface and otherl organs in body cavity(cranial, thoracic and abdominal) were not remarkable
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Histopathological findings of 4-week repeated intramuscular dose range finding study in SD rats(Group summary) External surface and otherl organs in body cavity(cranial, thoracic and abdominal) were not remarkable
Necropsy finding of 4-week repeated intramuscular dose range finding study in SD rats (Group summary)Grade- ±: minimal, +: mild
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Necropsy finding of 4-week repeated intramuscular dose range finding study in SD rats (Group summary) Grade- ±: minimal, +: mild
References
김 양강 1984 독성학 동화기술 15 - 18
허 인회 1993 독성학 신일상사 185-186 9 - 10
식품의약품안전청 식품의약품안전청고시 제2005-60호
Academic committee of KPI 2008 Pharmacopuncturology Elsevier Korea 167-199 3 -
Kwon KR , Koh HK 1998 An Experimental Study with Bee Venom Therapy on Anti-inflammatory and Analgesic Effects The Journal of Korean Acupuncture & Moxibustion Society 15 (2) 97 - 103
Ko SH 1992 Experimental Studies on the Effect of Bee Venom Theraphy on the Analgesic Anti-pyretic and Anti-inflammatory Action Korean Journal of Oriental Medicine 13 (1) 283 - 292
Kwon SH , Koh SJ , Kim SY , Park HI , Kim JD , Kang DY 1997 The Effect of Bee Venom Aqua - acupuncture on the Antitumor and Immune Response in the Epithelioma by 3 - MCA The Journal of Korean Acupuncture & Moxibustion Society 14 (2) 151 - 172
Lee KU , Hong BM , Jo JS , Byeon YK , Song SH , Kim KM 2003 The Clinical Study on Bee Venom Acupuncture Treatment on Osteoarthritis of Knee Joint The Journal of Korean Acupuncture& Moxibustion Society 20 (5) 73 - 8
Wang KM , Ahn KS , Lim SC , Jang JH 2001 Clincal Investigation Compared with the Effects of the Bee Venom - Acupuncture on Knee Joint with Osteoarthritis The Journal of Korean Acupuncture& Moxibustion Society 18 (3) 35 - 47
Kim HJ , Kang U , Kwon JS 2001 Three cases of affections of the hip treated with Korean Bee-Venom therapy Journal of Korean Pharmacopuncture Institute 4 (3) 122 - 130    DOI : 10.3831/KPI.2001.4.3.127
Lee DY , Lee KM , Baek SC , Kim DH , Park DJ , Hong TH , Yang KS , Kim KR , Lee , Choi , Lee 2003 Effects of Bee Venom on the pain edemaand acute inflammatory reactant of Rheumatoid Arthritis patients The Journal of Korean Acupuncture & Moxibustion Society 20 (2) 77 - 84
Lee KS , Hong SH , Kim SK , Yang HJ , Lee HS , Choi HJ , Lee SH , Lee HJ 2003 Randomized Controlled Double Blind Study of Bee Venom Therapy on Rheumatoid Arthritis The Journal of Korean Acupuncture & Moxibustion Society 20 (6) 80 - 88
Kim YC , Seo KR , Yun SH , Lee SH , Choi SJ , Lee SY , Lim HI , Seo JD , Jung DY , Han DI 2005 The Comparison of Bee Venom Herbalacupuncture Therapy between Neighboring Acupuncture Points and Neighboring-Remote Acupuncture Points on the Treatment of Lumbar Spine Herniation of Nucleus Pulpous The Journal of Korean Acupuncture & Moxibustion Society 22 (6) 181 - 187
Lee KU , Lee BM , Yem JS , Jang YK , Yun SH , Hwang KM , Kug SC , Jang JC , Choi TY , Kim , Park 2004 A Clinical study of Bee-venomacupuncture treatment on protrusion disc Patients The Journal of Korean Acupuncture& Moxibustion Society 21 (5) 13 - 25
Jun HJ , Hwang SH , Kim DJ , Nam KW , Kim KH 2003 Clinical Evaluation of Herniation of nucleus purposus patients treated by Bee venom therapy The Journal of Korean Acupuncture &Moxibustion Society 20 (5) 63 - 72
Lee HJ , Lee HJ , Yeom MS , Kim DJ , Kim HS 2006 A Clinical Study of Bee Venom Acupuncture Therapy on Shoulder Pain Patients in Stroke Sequelae The Journal of Korean Acupuncture & Moxibustion Society 23 (4) 69 - 80
Jeoung YJ , Kim CS , Park KR , Lim DY , Yoon KM , Ahn SC 2005 Clinical Study on the Effect of Bee Venom Acupuncture Therapy on the Poststroke Pain The Journal of Korean Acupuncture & Moxibustion Society 22 (3) 69 - 75
Choi JS , Kwon KH , Choi KR 2006 Purification of Peptide Components including Melittin from Bee Venom using gel filtration chromatography and propionic acid/urea polyacrylamide gel electrophoresis Journal of Korean Pharmacopuncture Institute 9 (2) 105 - 112    DOI : 10.3831/KPI.2006.9.2.105
Barbara HC , Rudolf. KH 1986 Chemistry and Pharmacology of Honey Bee venom Academic Press 329 - 402
Lim HJ , et al. , Lee SH , et al. , Kwon DJ , et al. , Barbara KW , et al. , Rudolf KH , et al. 2004 Antiarthritic effect of Bee Venom Arthritis & Rheumatism et al. 50 (11) 3504 - 3515    DOI : 10.1002/art.20626
Park HJ , et al. , Lee SH , et al. , Choi DJ , et al. , Son KW , et al. , Song KH , et al. , Song , et al. 2008 JNK pathway is involved on the inhibition of inflammatory target gene expression and NF-κB activation by melittin J.Inflammation et al. 5 (7) 1 - 13    DOI : 10.1186/1476-9255-5-1
Kim 상인 , Lim HJ , Kwon HJ 2009 Study of single dose toxic test of Sweet Bee Venom in rats Journal of Korean Pharmacopuncture Institute 12 (4) 5 - 32
Park KS , Lee KR , Kwon YJ 2010 Study of four week repeated dose toxic test of Sweet Bee Venom in Beagle Dogs Journal of Korean Pharmacopuncture Institute 13 (4) 5 - 42    DOI : 10.3831/KPI.2010.13.4.005
Yoon HC , Lee KH , Kwon KR 2010 Study of single dose toxic test of Sweet Bee Venom in Beagle Dogs Journal of Korean Pharmacopuncture 13 (4) 43 - 62    DOI : 10.3831/KPI.2010.13.4.043
Lim CS , Lee KH , Kwon KR 2010 Effects of Sweet Bee Venom on cardiovascular system in the conscious telemetered Beagle Dogs J. Pharmacopuncture 13 (3) 15 - 46    DOI : 10.3831/KPI.2010.13.3.015
식품의약품안전청 식품의약품안전청고시 제2008-56호
이 상인 1985 본초학 수서원 4 - 5
Kang KS , Kwon KR 2003 Clinical Studies on 5 Cases of Multiple Sclerosis by Acupuncture Therapies The Journal of Korean Acupuncture& Moxibustion Society 20 (1) 209 - 217
Kwon KR 2003 Clinical Studies of Amyotrophic Lateral Sclerosis(ALS) through Korean Medicine The Journal of Korean Acupuncture& Moxibustion Society 20 (3) 209 - 216
Lee JS , An CS , Kwon KR 2001 A Clinical Study on the case of Fascioscapulohumeral ( FSH )Muscular Dystrophy Treated with Traditional Korean Medicine The Journal of Korean Acupuncture & Moxibustion Society 18 (3) 227 - 238
Hwang YJ , Lee BC 2000 Clinical Study of Anaphylaxis on Bee-Venom Acupuncture The Journal of Korean Acupuncture & Moxibustion Society 17 (4) 149 - 159
Youn HM 2005 The Clinical Observation of Anaphylaxis on Bee-Venom Acupuncture The Journal of Korean Acupuncture & Moxibustion Society 22 (4) 179 - 188
Robert L , Ronald D , William S 1998 Allergy HypersensitivityAnaphylaxis. Emergency Medicine Mosby Year Book 2759 - 2766
Kwon KR , Chu CS , Park HS , Kim MK , Cha BC , Lee E 2007 Experimental studies of quantitative evalution using HPLC and safety of Sweet Bee Venom Journal of Korean Pharmacopuncture Institute 10 (2) 81 - 86
Kwon KR , Choi SH , Cha BC 2006 Component Analysis of Sweet BV and Clinical Trial on Antibody Titer and Allergic Reactions Journal of Korean Pharmacopuncture Institute 9 (2) 79 - 86    DOI : 10.3831/KPI.2006.9.2.079
Lee JS , Lee JY , Kwon KR , Lee HC 2006 A Study on Allergic response between Bee Venom and Sweet Bee venom Pharmacopunture Journal of Korean Pharmacopuncture Institute 9 (3) 61 - 77
Renata MS , Jorge A , Hugo V 2007 Structural and functional behavior of biologically active monomeric melittin J Molecular Graphics and Modelling 25 767 - 772    DOI : 10.1016/j.jmgm.2006.06.006
Lind DS , et al. , Hochwald SN , et al. , Malaty J , et al. , Rekkas S , et al. , Mishra G , et al. 2001 nuclear factor-κB is upregulated in colorectal cancer Surgery et al. 130 363 - 369    DOI : 10.1067/msy.2001.116672
Aranha MM 2007 NF-κB and apotosis in colorectal tumorigenesis Eur J Clin Invest 37 416 - 424    DOI : 10.1111/j.1365-2362.2007.01801.x