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Pharmacopuncture of Anti-inflammatory Herbal Compounds Suppresses Colon Inflammation-induced c-Fos like Protein Expression in Rats
Pharmacopuncture of Anti-inflammatory Herbal Compounds Suppresses Colon Inflammation-induced c-Fos like Protein Expression in Rats
Journal of Pharmacopuncture. 2010. Jul, 13(3): 47-62
Copyright ©2010, KOREAN PHARMACOPUNCTURE INSTITUTE
  • Received : July 19, 2010
  • Accepted : September 07, 2010
  • Published : July 30, 2010
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About the Authors
Jeong Bang Song
In Chul Sohn
Seong Hun Ahn
Jae Hyo kim
medicdog@wku.ac.kr

Abstract
Objectives
Colitis is an inflammatory bowel disease characterized by colonic mucosal inflammation and chronic relapsing events represents. The purpose of this study is to evaluate effects of pharmacopuncture of anti-inflammatory herbal compound (AiC) applied to the different acupoints in the acute colitis induced by trinitrobenzenesulphonic acid (TNBS) intracolonic injection in rats.
Methods
In Male Sprague - Dawley rats, weighing 250∼400g, TNBS (5 mg/kg) was infused intrarectally through a silicon rubber catheter into the anus under isoflurane anaesthesia. Acupoints of LI4 (Hapkok), ST25 (Cheonchu), ST36 (Joksamni), and BL25 (Daejangsu) were intramuscularly injected by AiC, respectively (injection volume & times: 0.2 ml / acupoint, twice times on the 2nd & 3rd day). Expressions of cFos protein in the periaqueductal gray (PAG), locus coeruleus (LC), nucleus of solitary tract (Sol), and the 6th lumbar spinal cord (L6 s.c.) were observed at 24 hr after TNBS induced colitis by immunohistochemistry.
Results
The expression of c-Fos protein in the L6 s.c., Sol, LC and PAG increased 24 hr after TNBS injection into colorectum as compared to normal and 50% ethanol treated group. AiC to LI4 inhibited the expression of c-Fos protein in Sol and PAG but not L6 s.c. and LC. AiC to ST36 showed significant inhibition the c-Fos expression in L6 s.c., Sol and PAG. AiC to ST25 only showed the effects in L6 s.c. and PAG. AiC to BL25 inhibited significantly the expression of c-Fos protein all over the areas. To investigate whether or not endogenous opioids are involved, intrathecal injection of naltrexone (30ug/30ul) was applied before the 2nd pharmacopuncture treatment 24 hr after TNBS-induced colitis in rat. Naltrexone reversed the inhibition of c-Fos protein expression in the spinal cord and brainstem.
Conclusions
These data show that pharmacopuncture of Aic potently inhibits signal pathways ascending hypersensitivity of colorectum after TNBS induced colitis and depends on the endogenous opioids according to acupoints.
Keywords
I. 서론
염증성 대장염은 한의학에서는 泄瀉, 腹痛, 腸癖, 痢疾등의 범주에 포함되는 질환으로 1 , 2) , 장기간에 걸쳐 혈변, 설사, 체중감소 등의 증상이 악화와 회복단계를 반복하는 특징을 지닌다 3) . 이러한 대장에 염증을 일으키는 질환은 크 게 궤양성 대장염(ulcerative colitis)과 크론씨 병(Crohn's disease)으로 구분하고 있으며 4) , 주요 원인은 감염, 식 사, 알레르기성, 자기면역 및 혈관성 요인 등 5) 으로 추측되고 있으나, 아직 확실히 밝혀져 있지 않은 상태로 만족할 만한 치료법 또한 없는 실정이다 6 , 7) .
염증성 대장염에 대한 치료는 濕熱, 脾腎兩虛, 脾虛, 腎 虛, 肝脾不和, 血瘀등 원인에 따라 淸熱利濕을 위주로 健 脾益腎, 活血和瘀, 利氣和血을 治療방향으로 제시하고 있다. 이를 바탕으로 약물 치료와 鍼灸치료가 적용되는데, 鍼灸치료에서 足三里, 天樞, 關元, 腎兪, 脾兪등이 많이 쓰이고 있다 8) .
최근의 많은 연구 결과를 통해 염증성 대장염에 대한 한의학을 통한 진단과 치료 가능성을 보여주는 사례를 보면, TNBS로 야기된 대장염에 대하여 灸津(moxi-tar)을 활용한 藥鍼이 合谷 9) , 大腸兪 10) , 天樞 11) 에 주입되었을 때 大腸炎 의 증상을 완화하고 염증을 억제하였으며, 艾葉 12) , 人蔘 13) 및 黃連 14) 을 이용한 藥鍼역시 大腸炎에 有效한 효과를 나타내었다. 또한 선행연구에서는 露蜂房藥鍼 15) 이 穴位에 따라 대장염과 관련된 중추신경계의 c-Fos 단백 발현을 다르게 억제하는 것이 관찰되었다. 이처럼 다양한 종류의 약물을 이용한 藥鍼이 염증성 대장염의 증상을 완하하거나 치료하는데 효과적임을 알 수 있다.
근래 消炎藥鍼을 이용한 다양한 연구에서 消炎과 鎭痛 작용에 대한 治療效果가 드러나고 있으나 16 - 19) , 아직까지 大 腸炎과 관련한 消炎藥鍼에 대한 연구는 없었다. 본 연구 는 흰쥐의 急性大腸炎으로 야기되는 중추신경계의 c-Fos 단백 발현의 변화를 바탕으로 消炎藥鍼을 이용한 穴位에 따른 효과 밝히기 위하여 비교 연구하였다.
II. 실험재료 및 방법
- 1. 실험동물
실험동물은 체중 250 ∼ 400g의 Sprague - Dawley계 숫컷 흰쥐(샘타코, 한국)를 사용하였으며, 실험 1주일 전부터 온도 22±1℃, 상대습도 55±10%의 조건에서 실험실 환경에 적응할 수 있도록 하여 stress 및 환경의 변화에 따른 영향을 최소화하였다. 실험하기 전 및 실험 기간에 동물들은 사료와 물을 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다.
- 2. 동물마취
모든 수술 또는 刺戟동안 실험동물은 3% isoflurane( 중외제약, 한국)과 95% 산소(O 2 )를 포함한 혼합가스를 2ℓ/min로 마취하였으며, 마취가 이루어진 뒤 0.5 ∼ 1% isoflurane과 95% 산소의 혼합가스로 마취를 유지하였다.
- 3. 급성 대장염 유발
실험동물의 대장염 유발 전날부터 금식시킨 후, 2, 4, 6- trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS, Sigma- Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 5㎎/㎏과 50% Ethanol을 각각 일대일로 혼합한 용액 0.8㎖을 준비하였다. 백서를 isoflurane으로 마취시킨 후 외경 0.2㎝, 길이 8㎝의 polyethylene catheter를 흰쥐 항문으로 삽입하여 5㎎/㎏ TNBS/ 50% ethanol 혼합용액 0.8㎖을 1회 주입 하여 대장염을 유발시켰다.
- 4. 消炎藥鍼(Anti-inflammatory compound) 약물 구성 및 약침액 제조
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대한약침학회에 증류약침으로 제조의뢰 하여 공급 받아 사용 하였고, 증류약침의 제조 과정 20) 은 다음과 같다.
① 약재 처방 및 세척: 약재를 채반에 담아 3차 증류수(Ultra Pure 900, USA)에 세척한다.
② 약재의 침출: 반응 조 하부에 약재 400g과 3차 증류 수 2500ml을 60분 동안 실온상태에 두어 약재를 침출한다.
③ 전탕: 약재 침출 후 105℃에서 120분간 전탕을 한다.
④ 추출: 107℃에서 발생되는 수증기를 증류 냉각관을 통해 냉각 추출한다(냉각 추출시간 약 3시간).
⑤ 무기 염류의 침강: 추출이 끝나고 1리터 Pyrex용기에 받아진 약침액은 무기염류를 침강시키기 위해서 하루 동안 냉장 보관한다.
⑥ 등장액 및 pH 조절: 상층액을 분리하여 pH 7.25∼7.35 (Na 3 PO 4 , 덕산) 조절, NaC l 을 첨가하여 0.9% 등장액이 되게 한다.
⑦ 여과: 0.45㎛ → 0.2㎛ → 0.1㎛ (whatman cellulose) 순서로 여과하고, 소분, capping 및 멸균을 통 해 약침액을 완성한다.
- 5. 취혈
실험동물을 isoflurane (중외제약, 한국)과 95% 산소(O 2 )를 포함한 혼합가스로 마취한 상태에서 兩側合谷(LI4), 足三里(ST36), 天樞(ST25)와 大腸兪(BL25)를 各 各取穴하였다 21) ). 合谷(LI4)의 위치는 인체의 "손등에서 첫 번째 손 허리뼈와 두 번째 손 허리뼈 사이로서 두 번째 손 허리뼈 가운데 점"을 근거로 하여 흰쥐에 상응하는 앞발에 서 취혈 하였다. 天樞(ST25)의 위치는 인체의 "배꼽 양쪽 2寸"을 근거로, 흰쥐 腹部에서 치골결합과 칼 돌기 끝단을 연결한 선을 12등분하여, 아래에서 5/12에 해당하는 곳을 神闕(CV8)로 정하였고 神闕의 수직선상과 유두의 수직선 상의 중간점을 天樞로 취혈 하였다. 足三里(ST36)는 "犢鼻(ST35) 아래 3寸으로 무릎을 'ㄱ'자로 굽혔을 때 정강뼈 거친 면과 종아리뼈머리 사이로서 정강뼈 거친 면 쪽의 앞 정강 근 안쪽"을 근거로 흰쥐 하지 경골조면 선상과 앞 정강근 사이에서 取穴하였다. 위치는 犢鼻와 발목관절 앞쪽을 연결한 선상에서 대략 1/5에 해당하는 곳으로 정하였고, 大腸兪(BL25)는 흰쥐의 3-4요추 간에서 양쪽으로 1.5寸에 해당되는 곳으로 요추간 에서 요측부 끝단을 10등분하여 요추 간에서 1/10과 2/10의 중간 부위를 取穴하였다.
- 6. 약물과 길항제
흰쥐를 하루 동안 금식시킨 후 다음 날 50% ethanol에 녹인 TNBS를 5㎎/㎏ 농도로 0.8㎖을 대장으로 1회 주입 하였다. 藥鍼의 효과를 살펴보기 위해서 전신마취상태에서 兩側合谷(LI4), 天樞(ST25), 足三里(ST36)와 大腸兪(BL25)에 해당하는 상응부위의 혈위에 藥鍼용액 0.2㎖ 를 하루에 한번씩 2일에 걸쳐 총 2회 시술하였다. 약침 효과의 기전을 확인하기 위하여 내재 진통 물질인 opiates의 길항제인 naltrexone hydrochloride (30ug/30ul; Sigma, St. Louis, MO, USA)를 대장염 유발 후 다음날에 약침 투여 30분 전에 척수강(intrathecal injection)으로 주입하였다. 실험동물은 대장염 유발군(TNBS)과 대장염 유발 후 약침군으로 나누어 관찰하였다 (Fig. 1) .
- 7. 면역조직화학 염색법
대장염을 유발시킨 후 24시간째에 실험동물을 urethane으로 과량 마취하여 깊은 마취 상태를 유발한 뒤에 250㎖의 0.1M phosphate buffer (PB) 용액으로 심장을 관류하여 혈액을 제거하였으며, 다시 0.1M PB 용액으로 희석한 500㎖ 의 4% paraformaldehyde로 관류시킨 후 뇌와 척수를 박리하였다. 박리된 뇌와 척수는 4% paraformaldehyde로 4시간 동안 실온에서 고정한 후 30% sucrose에서 2일 이상 방치하였다. 조직은 냉동 절편 기(Cryostat, Leica Microsystems GmbH, Germany)를 이용하여 40㎛의 두께로 조직 절편을 만들어서 세포내 peroxidase의 활성을 억제하기 위하여 10% H 2 O 2 용액에서 20분 동안 진탕하고, 그 후 pH 7.4의 PBS 용액으로 3회 이상 세척하고 0.5% Triton-X 100으로 20분간 진탕한 후 PBS로 2회 이상 세척하였다. 그 후 다원일차항체(cFos, Oncogene Sci, USA, 1:1000)를 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후 2시간 동안 실온에서 진탕시키고 PBS로 세척하였다. 그 후 이차항체인 biotinylated antirabbit & anti-mouse immunoglobulin (Dako,Denmark) 을 실온에서 40분간 처리하여 PBS로 세척하고, streptavidin peroxidase (Vector ABC kit)를 90분간 처리하여 PB로 세척한뒤 chromogen인 0.05% diaminobenzidine으로 발색하였다. 증류수로 1시간 동안 세척한 후 광학 현미경 하에서 진갈색의 cFos 양성 세포를 화상 자동분석 시스템(Image-Pro Plus, USA)을 이용하여 cFos 단백 양성 세포 숫자를 측정하였다. c-Fos 양성 세포들은 뇌수도관 중심 부위(periaqueductal gray, PAG), 청반핵(locus coeruleus, LC), 고립로핵(nucleus of solitary tract, Sol)과 여섯 번째 요척수 후각(6th lumbar spinal cord, L6 s.c.)에서 측정하였다.
- 8. 통계
컴퓨터 통계프로그램인 Sigma Stat 3.0(SPSS Inc., USA)을 이용하였으며, 실험결과는 means ± S.D.로 나타내었고, 통계검사는 unpaired student t-test와 Duncan's multiple comparison post-hoc test에 의한 ANOVA로 하였다. p값이 0.05보다 작으면 통계적으로 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
III. 실험결과
- 1. 급성 대장염 유발에 따른 중추 신경계 c-Fos 단백 발현의 특징
TNBS(2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid) 5 ㎎/㎏를 흰쥐의 직장에 주입하고 24시간이 경과한 뒤 중추신경계 각 부위에서 c-Fos 단백 발현을 관찰하였다. TNBS를 50% ethanol에 희석하여 주입하였기에 50% ethanol만 주입한 후 같은 시간이 경과한 뒤 중추신경계에서 c-Fos 단백 발현을 관찰하였다.
정상 흰쥐의 경우 여섯 번째 요척수 후각(L6 s.c.)에서 c-Fos 단백이 거의 관찰 되지 않은 반면, 50% ethanol 주입군에서 적은 c-Fos 단백(5.5±2.7개)이 관찰되었고, TNBS 주입 후에는 c-Fos 단백이 크게 증가하였다(25.3 ±5.9개, P<0.01) (Fig 2) .
정상 흰쥐의 경우 고립로핵(Sol)에서의 c-Fos 단백은 2.3±3.9개로 매우 적은 수가 관찰되었고, 50% ethanol 주입 후에도 정상 상태에 비하여 c-Fos 단백의 발현에 변화가 없었다(5.3±4.1개). 그러나 TNBS 주입 후에는 35.9±10.6개(P<'0.01)로 유의하게 증가하였다 (Fig 3) .
정상과 50% ethanol을 주입한 실험동물 모두 청반점핵(LC)에 c-Fos 단백 발현이 거의 관찰 되지 않았고, TNBS 주입군은 15.6±4.51개(P<'0.01)로 크게 증가됨을 관찰 하였다 (Fig. 4) .
정상 흰쥐의 경우 뇌수도관 중심 부위(PAG)에서의 적은 숫자의 c-Fos 단백이 관찰 되었으며(5.7±3.8개), 50% ethanol 주입군 역시 9.5±4.1개 정도로 적은 숫자가 발현되었다. 반면 TNBS 주입군은 43.9±16.7개(P<'0.01)로 c-Fos 단백이 PAG 부위에서 증가하였다 (Fig. 5) .
- 2. 급성 대장염에서 消炎藥鍼의 c-Fos 단백 발현 에 미치는 영향
TNBS 용액을 대장 내에 주입하여 급성 대장염을 야기 할 때, 중추 신경계내 요척수, 고립로핵, 청반점핵과 뇌수도관 중심 부위에서 c-Fos 단백이 크게 증가함을 확인하였다. 이를 근거로 消炎藥鍼을 급성 대장염 유발 후 2회 시술한 후, c-Fos 단백 발현을 비교 관찰하였다. 또한 消炎藥 鍼의 효과가 經穴에 따라 변화하는지를 살피기 위해 合谷, 足三里, 天樞, 大腸兪에 각각 시술하여 비교 관찰하였다.
合谷(LI4)에 消炎藥鍼을 시술한 경우, 여섯 번째 요척수 후각(L6 s.c.)에서 c-Fos 단백이 유의하게 감소하지 않았다(25.3±5.5개). 그러나 고립로핵(Sol)에서 대장염 실험군(45.2±10.2개) 보다 유의하게 발현이 감소하였다(24.1±11.6개, P<'0.05). 청반점핵(LC)은 L6 s.c. 부위 처럼 c-Fos 단백이 감소하지 않았으며, 뇌수도관 중심 부위(PAG)에서는 대장염 실험동물(46.3±12.3개)에 비하여 消炎藥鍼시술 후 21.9±14.6개(P<'0.05)로 유의하게 c-Fos 단백이 감소하였다(Fig. 6 & 7 ).
足三里(ST36)에 消炎藥鍼을 시술한 경우, L6 s.c.에서 대장염 실험군(34.1±'8.2개)에 비해 c-Fos 단백이 15.7 ±4.5개(P<'0.01)로 감소되었고, Sol에서도 27.2±9.3개 (P<'0.05)로 감소하였으며, PAG에서는 크게 감소하였다(15.6±5.2개, P<'0.001). 그러나 LC에서는 合谷에 대한 약침시술과 비슷하게 c-Fos 단백의 발현이 감소되지 않았다(Fig. 6 & 7 ).
天樞(ST25)에 대한 消炎藥鍼의 시술은 L6 s.c.에서 c-Fos 단백이 유의하게 감소되었고(18.9±6.4개, P<'0.01), PAG에서도 c-Fos 단백이 뚜렷하게 감소되었다(25.4±10.2개, P<'0.05). 그러나 Sol과 LC에서는 c-Fos 단백이 뚜렷하게 감소되지 않았다(Fig. 6 & 7 ).
급성 대장염 유발 후, 大腸兪(BL25)에 대한 消炎藥鍼을 시술한 경우 L6 s.c.에서 c-Fos 단백발현 숫자가 15.6±5.8개(P<0.01)로 감소하였고, Sol에서도 뚜렷하게 감소 하였다(21.6±9개, P<0.01). LC에서 c-Fos 단백발현 숫자가 4.3±8.6개(P<'0.01)로 유의하게 감소하였으며, PAG에서도 23.1±10.4개(P<'0.05)로 감소하였다(Fig. 6 & 7 ).
- 3. 내재진통계가 消炎藥鍼의 c-Fos 단백 발현 억제에 미치는 영향
TNBS 주입으로 유도된 급성대장염에서 소염 약침이 중추신경계의 c-Fos 단백 발현을 억제하는 효과가 신경조절물질이자 진통물질로 알려진 opioid와 관련이 있는지를 찾고자, TNBS로 급성 대장염을 유발 후 naltrexone(30ug/30ul)을 각 부위 약침 시술 30분 전에 척수강(intrathecal injection)으로 주입하여 약침 효과에 미치는 영향을 관찰하였다.
naltrexone을 전처치한 대장염 실험동물에서 合谷에 대한 消炎藥鍼시술에 의해 Sol과 PAG에서 c-Fos 단백이 감소되었던 효과가 관찰되지 않았다. 오히려 Sol과 LC에 서 naltrexone 처치는 약침 시술에 불구하고 c-Fos 단백 발현이 증가하는 경향을 나타내었다. 이는 消炎藥鍼에 의한 c-Fos 단백 발현 감소가 내재진통물질과 상관성이 있음을 나타내는 것이다. 마찬가지로 naltrexone 처치한 경우에 足三里(ST36) 消炎藥鍼은 다른 經穴에 비하여 c- Fos 단백이 감소된 경향을 살펴볼 수 있었으나 유의한 수준으로 c-Fos 단백이 감소하지 않았다. 天樞(ST25)에 대한 消炎藥鍼은 naltrexone 처리 후, Sol, LC, PAG 모두에서 c-Fos 단백 발현 억제가 차단되었고, L6 s.c.에서는 오히려 c-Fos 단백이 증가하는 경향을 나타내었다. 大腸兪消炎藥鍼이 L6 s.c.에서 c-Fos 단백이 감소하는 경향을 보여 주었으나(21.1±5.9개), naltexone을 투여하지 않은 상황에 비해 c-Fos 단백이 감소하는 효과가 차단되었고, 나머지 영역에서도 c-Fos 단백이 감소하지 않았다(Fig. 8 & 9 ).
IV. 고찰
대장의 염증을 일으키는 질환으로 궤양성 대장염(ulcerative colitis)은 직장에서 시작하여 전 대장에 파급되는 점막 질환으로 점막 충혈, 과립성 표면, 출혈, 부종 및 궤양 등을 나타내고, 오랜 경과를 지낸 경우에는 상피 재생의 결과로 염증성 용종이 나타날 수 있다. 그리하여 경과가 오래된 경우 위축으로 모양을 상실하여 대장이 좁아지고 짧아지게 되고, 전격성 염증이 있는 경우에 점막이 얇아지고 심한 궤양을 동반하는 독성 장염 또는 독성 거대 결장으로 발전하여 천공이 유발 될 수 있다. 궤양성 대장염의 주요 임상 증상은 설사, 직장 출혈, 후중, 점액 배출 및 경련성 복통이 나타나고 그 외에 구토, 발열, 체중감소 등이 동반 된다 4 , 22) . 또한 크론씨 병(Crohn's disease)은 주로 젊은 성인에게 발병하며 섬유화 나 궤양을 수반, 소화관의 온갖 부위에 전층성·비연속성으로 퍼지는 만성의 원인불명의 육아종성 염증성질환으로 임상 증상으로는 복통이 가장 흔한 증상이며 기타 체중감소, 설사, 발열의 순으로 많다 4 , 22) . 활동성일때 점성 염증과 누공 형성이 특징적이며, 섬유화 및 장협착으로 이어져 장벽이 두꺼워지고 좁아지며 만성적이고 반복적인 장 폐쇄를 유발한다. 또 장막 및 장간막의 염증으로 유착 및 누공이 형성 되고, 대장염이 동반된 항문주위 질환의 경우에는 경도의 발열, 설사, 경련성 복통 및 혈변이 나타날 수 있다. 통증은 염증으로 좁아진 대장 내강으로 대변이 통과 하면서 유발되며, 설사의 경우는 대장염으로 인해 직장의 순응도가 낮아진 데에 원인이 있고, 혈변은 궤양성 대장염만큼 흔하진 않으나 대장에 질환이 있는 환자의 반수에서만이 나타나고 심한 출 혈은 1∼2%에서만이 동반 된다 23) .
炎症性大腸炎의 原因이나 病態生理및 치료법의 연구를 위한 동물 모델로 4~10%의 acetic acid 나 50% ethanol에 녹인 TNBS를 흰쥐의 항문에 주입 했을 때 급성 및 만성 염증성 대장염이 유발이 있다 24 , 25 ). 이는 인체 염증성 대장염과 유사성 때문에 acetic acid와 TNBS가 가장 널리 이용되었는데 최근에는 acetic acid보다 TNBS가 사람의 염증성 대장염에 가까운 병변을 일으킨다고 보고되고 있다 24 , 25) . TNBS를 1회 주입 2시간 후에 이미 점막 상피세포의 미란이 발생한다고 알려져 있으며 주입 후 48시간 후에 이미 급성 궤양의 육안적 소견이 발견되고 약2주 후에 만성 염증으로 이행하는 정도가 심하였다 26) . 이는 궤양성 대장염보다는 크론씨 대장염에서 흔히 관찰되는 전벽성 궤양 등의 심한 병변을 유발할 수 있고 염증성 대장염의 유발 원인으로 면역기전과 감염요인이 알려져 있는데, TNBS는 면역기전을 유발 시킬 수 있는 hapten으로 작용한다는 점과 급성 점막손상이 사라진 후에도 만성 염증을 지속시켜 주입 후 8주까지 그 염증이 지속된다 27) . 또 염증성 대장염의 점막염증을 유발하고 지속시킬 수 있는 화학적 매개자로 cyclooxygenase와 leukotriene B4의 상승이 급성에서 만성염증으로 넘어가는 시점인 2주 후에 특히 높아 매개자로 중요한 역할을 한다고 보고하 였다 6) . 이와 관련하여 본 실험에서도 TNBS/ethanol의 직장 내 투여는 체중감소와 설사를 유발하였고, 심한 혈성병변(bleeding)과 장두께의 증가를 동반한 장 점막 궤양과 염증이 관찰되었다.
이러한 염증성 대장염에 대한 한의학적 治療方法은 주로 藥物과 鍼灸治療法으로 대별 되며, 침구치료에 있어서도 鍼, 灸와 藥鍼치료로 나눌 수 있는데 治療에 많이 사용되는 經穴로는 合谷(LI4)과 足三里(ST36), 天樞(ST25), 大腸兪(BL25) 등이 있다.
合谷(LI4)은 大腸의 原氣가 經過하고 留止하는 經穴인 原穴이다 21) . 原穴이 原氣와 관계가 있으며, 原氣는 三焦를 통해서 밖으로 散布되는바, 그 氣가 유지하는 부위가 原穴이 되며 五臟六腑의 병이 있을 때에는 原穴을 取穴한다고 밝히고 있어 炎症性大腸炎의 治療穴로 合谷(LI4)이 타당함을 뒷받침한다. 足三里(ST 36) 는 急慢性胃腸炎, 腹痛등의 胃腸疾患과 脚氣虛弱體質貧血高血壓등을 포함한 急慢性胃腸病, 腹脹, 泄瀉, 食慾不振등 소화기계의 각종 질환에 활용되고 있다 28) . 또한《靈樞·本輸》에서는 大腸과 小腸의 病變을 모두 足陽明胃經에서 치료할 수 있음을 설명하였으며, 《靈樞·四時氣에서는 腹中不便의 병증에 足 三里를 사용하였다 29) . 天樞(ST25)는 大腸의 募穴로 疏阻 大腸調中和胃하며, 腸疾患, 泄瀉, 便秘, 痢疾, 慢性胃腸 病, 亂, 腹冷痛, 臍疝繞臍痛, 食不下, 久瀉不止等을 치료한다 30) 《備急千金要方卷三十·心腹第二》 31) 에서는“大 便不節小便赤黃腸鳴泄注...... 大便泄數病灸天樞”이라 했으며, 《千金翼方》에서는“冷及夫人, 癖腸鳴瀉利, 絞痛, 灸天樞百壯, 三報之”라고 하여 急·慢性大腸炎에 多用되었다 21) . 大腸兪(BL 25) 는 腸炎, 腸痙攣, 腸出血, 泄瀉, 腹 痛, 腸鳴腹脹, 臍部激痛等의 大腸疾患과 大小便不利等을 主治한다고 알려져 있다 30) .《鍼灸大成》 32) 에서 洞泄에 大腸 兪을 활용하였다. 臟腑와 經脈의 氣가 흘러나오는 부위이 므로 背兪穴과 臟腑는 특수한 관계가 있으며 임상에서 五 臟六腑의 虛實과 盛衰를 가장 잘 반영하게 되므로 炎症性 大腸炎의 治療穴로 大腸兪(BL25)가 妥當함을 뒷받침하고 있다.
消炎藥鍼의 약물의 구성을 살펴보면, 黃連解毒湯에 蒲公英, 金銀花, 生地黃, 連翹의 藥物이 加味되여 있음을 알 수 있다. 黃連解毒湯이란 葛洪 33) 의《後備急方》에 처음 나오는 處方으로, 淸熱燥濕, 瀉火解毒, 消炎作用이 있는 黃連, 黃芩, 黃柏, 梔子등의 藥材들로 구성되어 一切의 火熱, 大熱煩燥및 一切熱毒을 치료하며 34) , 대장염의 治療處方에 응용되고 있다.
실험적 연구로는 腸管의 弛緩作用에 대한 연구와 35) , 흰쥐의 DSS로 유발된 궤양성 대장염의 병태 모델에 黃連解毒湯을 투여하여 육안적 형태변화, 조직학적, 면역조직화학적 및 전자현미경적 관찰을 통하여 대장염으로 손상된 조직의 회복과 염증의 감소에 효과가 있다고 보고하고 있다 36) .
消炎藥鍼에 대해서는 근래 권 등 37) 은 소염약침이 해독작용과 청열작용이 있으며 염증과 진통을 위해 사용된다 고 보고하고 있고, 유 등 18) 은 통증이 동반된 암 환자에 대한 소염약침의 효과에서 진통 효과가 있는 것으로 보고하고 있으며 김 등 17) 도 건염 치료에서 진통효과가 있다고 보고하고 있다. 이처럼 消炎藥鍼의 消炎작용 및 鎭痛작용이 있으므로 TNBS로 유도된 염증성 대장염의 염증과 동통에 대하여 중추신경계의 c-Fos 단백 발현에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 효과를 관찰하고자, 合谷(LI4), 足三里(ST36), 天(ST25), 大腸兪(BL25)를 선택하여 본 실험을 진행하였다.
흰쥐를 1일 동안 금식시킨 후 다음 날 TNBS를 흰쥐의 직장으로 1회 주입한 결과, 요척수, 고립로핵, 청반점핵, 뇌수도관 중심 부위에서 c-Fos 단백이 크게 증가하였데, c-Fos 단백은 일정한 자극으로 높아진 신경 흥분성과 관련하여 신경세포에서 발현되는 초기발현 유전인자 중의 하나로 신경세포의 활동성을 관찰하는 표식자로 사용되어 왔다. Hunt 등38)은 마취된 흰쥐의 말초부위에 유해성 자극을 가하여 척수에 존재하는 신경세포에서 c-Fos 단백질의 관찰을 시작하였고, 그 뒤 척수부위에서 痛症정도를 확인하는 표식자로써 활용되어 왔다 39) . 유해성 자극은 30분내에 c-Fos mRNA를 발현시키며, immunoreactive 신경세포의 관찰은 1-3시간 사이에 가장 많이 관찰되는 것으로 알려져 있다 40) .
TNBS의 대장 내 주입군 에서 혈위 별 消炎藥鍼이 중추신경계의 c-Fos 단백발현에 미치는 영향에서 혈위별로 비교해보면, L6 s.c.에서는 大腸兪(BL25)에서 감소 효과가 뛰어났으며, Sol에서 天(ST25)를 제외한 혈위에서 c-Fos 단백이 감소되었고, LC에서는 大腸兪(BL25)에 시술할때 유효한 효과를 보였고, PAG에서 c-Fos 단백 발현은 足三里(ST36)의 시술이 가장 뚜렷한 효과를 보였다. TNBS의 대장 내 주입으로 유도된 급성대장염에서 消炎藥鍼의 c-Fos 단백 발현 억제효과가 중추신경계의 중요 신경조절물질로 알려진 opioid와 관련이 있는지를 찾고자, TNBS의 대장 내 주입군에 다시 naltrexone을 藥鍼투여 30분 전에 척수 강으로 주입하였다. 그 결과, naltrexone 처치된 급성대장염 실험군에서 c-Fos 단백발현은 증강되는 양상을 보였으며, 이러한 상황에서 消炎藥鍼은 c-Fos 단백을 감소시키는 효과가 관찰되지 않았다. 그런데 기존의 연구결과 15) 에서, 露蜂房藥鍼은 naltrexone 처리 후에도 L6 s.c. 및 PAG에서 c-Fos 단백 발현을 계 속하여 감소시키는 경향을 보여주었다. 露蜂房藥鍼은 c-Fos 발현 영역 별로 naltrexone에 의하여 영향을 받기도 하지만, 合谷(LI4) 과 大腸兪(BL 25) 를 중심으로 naltrexone에 의한 영향을 받지 않고 있었다. 이는 穴位의 특징보다는 藥鍼의 약물적인 효과에 의존하고 있다는 점을 추측하게 한다.
이러한 결과를 통해 消炎藥鍼이 消炎作用및 鎭痛作用이 있었고 炎症性大腸炎의 炎症과 疼痛에 대하여 혈위에 따라서 중추신경계의 c-Fos 단백 발현을 억제하였고, 내재 진통계와 관련하여 炎症性大腸炎과 관련한 증상완화 및 치료법이 될 수 있을 것으로 사료된다.
V. 결론
급성대장염에서 중추신경계 특정 부위의 c-Fos 단백발현을 관찰하여 穴位에 따른 消炎藥鍼의 효과를 살펴보 았다.
1. 대장내 TNBS 주입으로 급성대장염 유발 후, 요척수후각, 고립로핵, 청반점핵 및 뇌수도관 주위에서 c-Fos 단백이 크게 증가하였다.
2. 合谷에 대한 消炎藥鍼은 고립핵로와 뇌수도관주위의 c-Fos 단백 발현을 억제하였다.
3. 足三里에서 요척수 후각, 고립핵로 및 뇌수도관주위의 c-Fos 단백 발현을 억제하였다.
4. 天樞에서 요척수 후각 및 뇌수도관주위의 c-Fos 단백 발현을 억제하였다.
5. 大腸兪에서 요척수 후각, 고립로핵, 청반점핵 및 뇌수 도관주위에서의 c-Fos 단백 발현을 유의하게 억제하였다.
6. Naltrexone 전처치로 c-Fos 단백의 억제효과가 혈위와 상관없이 차단되었다.
이상의 결과, 消炎藥鍼은 穴位에 따라 급성대장염으로 야기된 중추신경계의 c-Fos 단백 발현을 유의하게 억제하였고, 이러한 효과는 내재진통계와 관련이 있었다. 향후 추가적인 연구를 통하여, 급성 대장염에 대한 소염약침의 효과에 관련한 여러가지 기전의 관련성 추가로 진행할 필요가 제기된다.
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Schematic draws to show the experimental schedule.
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Schematized map illustrating the 6th lumbar spinal cord (L6 s.c.) and the representative expression of c-Fos like protein 24 hours after TNBS-induced inflammation of the colon. (A), schematic drawing of the 6th lumbar spinal cord (L6 s.c.); (B), a number of c-Fos like protein expression in each group; NOR, normal control rat (C, c); ALCO, 24 hours after colorectal administration of 50% ethanol (D, d); TNBS, 24 hours after colorectal administration of a 1:1 mixture of TNBS 5 ㎎/㎏ and 50% ethanol (E, e). Arrows indicate an immunoreactive c- Fos like protein; dot lined boxes mean magnified area of related images. * P < 0.05, ** P < 0.01.
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Schematized map illustrating the nucleus of solitary tract and the representative expression of c-Fos like protein 24 hours after TNBS-induced inflammation of the colon. (A), schematic drawing of the solitary tract; (B), a number of c-Fos like protein expression in each group; NOR, normal control rat (C, c); ALCO, 24 hours after colorectal administration of 50% ethanol (D, d); TNBS, 24 hours after colorectal administration of TNBS (E, e). Notations are the same as the previous figures. * P < 0.05, ** P < 0.01.
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Schematized map illustrating the locus coeruleus (LC) and the representative expression of c-Fos like protein 24 hours after TNBS-induced inflammation of the colon. (A), schematic drawing of the locus coeruleus (B), a number of c-Fos like protein expression in each group; NOR, normal control rat (C, c); ALCO, ethanol administration (D, d); TNBS, TNBS administration (E, e). Notations are the same as the previous figures. * P < 0.05, ** P < 0.01.
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Schematized map illustrating the periaqueductal gray (PAG) and the representative expression of c-Fos like protein 24 hours after TNBS-induced inflammation of the colon. (A), schematic drawing of the periaqueductal gray; (B), a number of c-Fos like protein expression in each group; NOR, normal control rat (C, c-L, c-R); ALCO, ethanol administration (D, d-L, d-R); TNBS, TNBS administration (E, e-L, e-R); L & R, left side & right side of PAG. Notations are the same as the previous figures. * P < 0.05, ** P < 0.01.
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Representative photographs illustrating effects of pharmacopunctures on the expression of c-Fos like proteinafter TNBS induced colitis. TNBS, 24 hours after colorectal administration of a 1:1 mixture (0.8 ml) of TNBS 5㎎/㎏ and 50% ethanol; LI4, Hapkok; ST25, Cheonchu; ST36, Joksamni; BL25, Daejangsu. Scale bar = 100㎛.Notations are the same as the previous figures.
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Effects of pharmacopunctures on the expression of c-Fos like protein at 24 hours after colorectal administrationof a single colorectal administration of TNBS. All data are expressed as mean ± S.D. n = 5 in each group.Notations are the same as the previous figures. * indicates statistical significant differences (* P < 0.05, **P<0.01, *** P<0.001).
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The role of endogenous opioid reversing the effect of pharmacopunctures on the expression of c-Fos like proteinat 24 hours after TNBS induced colitis. Nalt, Naltrexone (30 ㎍ / 30 ㎕) was intrathecally administered 30min before pharmacopuncture under TNBS induced colitis. Notations are the same as the previous figures.
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The involvement of endogenous opioid for the effect of AiC pharmacopunctures on the expression of c-Fos likeprotein on TNBS induced colitis. Notations are the same as the previous figures. n = 5 in each group.
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