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The effects of Danggwisusan on restoration ability in wound induced animal models
The effects of Danggwisusan on restoration ability in wound induced animal models
The Korea Journal of Herbology. 2014. Sep, 29(5): 55-63
Copyright © 2014, The Korea Association Of Herbology
  • Received : August 18, 2014
  • Accepted : September 12, 2014
  • Published : September 30, 2014
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About the Authors
지원 박
jiwon3240@naver.com
부용 심
동희 김
dhkim@dju.kr

Abstract
Objectives :
The purpose of this study was verification of the restoration ability effect of Danggwisusan extract(DG) in wound induced Rat.
Methods :
It needed to make a scar(around 2 × 2㎠) on the top of the fascia in the back of the rats and then the rats were divided into 4groups(n=6). Control was not treated at all, where as DG was orally medicated DG, Terra was percutaneously applied Terramycin, and DG + Terra was both orally medicated DG and percutaneously applied Terramycin per day for three weeks.
Results :
93% or higher cell viability was observed in all tested groups from 1, 10, 100 ㎍/㎖ in RAW 264.7cells. The DG decreased NO and cytokine production activity dose dependently. The production of IL-1 β , IL-6 and TNF- α were decreased by 46%, 46% and 40% in DG treated 100 ㎍/㎖. The size of wound was significantly decreasing in DG, Terra, DG + Terra. WBC was significantly reduced in DG and DG + Terra. Monocyte was significantly reduced in DG, Terra and DG + Terra. Neutrophil was also reduced in DG, DG + Terra but not meaningless. The mRNA expression of MMP-1 was significantly reduced in Terra, MMP-2 was significantly reduced in DG, Terra, DG + Terra, and MMP-9 was significantly reduced in DG + Terra.
Conclusions :
According to the results, we thought that DG showed anti-inflammatory activities on the RAW 264.7cells in mouse macrophage and in adult rat wound. Moreover, the progress of recovery was found visually, heamatologically, genetically and histopathologically. In conclusion, it could be thought that DG has effect on the treating of wound.
Keywords
서 론
산업 발달로 인한 환경적인 변화와 자연재해나 외부적 요인에 의해 창상 및 화상과 같은 피부질환이 급증하고 있다. 인체를 구성하고 있는 피부는 외부환경의 여러 유해한 자극으로부터 인체의 내부 장기를 보호하고, 체내의 수분이나 전해질 등의 외부 유출을 박는 장벽 기능과 체온 조절 및 외부변화를 감지하는 감각 기능을 가진 인체조직이다. 외부요인으로부터 우선적인 방어기능을 함으로써 인체 조직기관 중 가장 먼저 손상이 되고, 이러한 손상이 부위가 광범위하면 생명유지에도 큰 영향을 미친다 1 , 2) .
한의학적인 창상의 치료법은 初期, 成膿, 潰後의 세단계로 나누며, 치료법칙도 이에 따라 消, 托, 補의 세가지의 기본법칙으로 분류된다. 그 중 消法은 병변의 손상을 초기에 消散시키고, 托法은 화농되어 있지 않거나 부패한 조직을 조속히 화농시켜 消退하며, 補法은 창상 후기에 국한적으로 파궤된 후 장기간에 걸쳐 유합되지 않는 경우에 사용한다고 알려져 있다 3) . 또한 창상 치유에 관한 연구로 이 4) 의 고압산소, 김 5) 의 맥동초음파와 냉 적용, 한 6) 의 스테로이드와 비스테로이드 소염진통제, 유 7) 의 연고제 등을 이용한 다양한 치유 방법과 효과에 대한 보고는 많으나, 한의학적인 효과에 대한 연구결과는 미흡한 편이다.
當歸鬚散은 明代에 저술된 李 8) 의 ≪醫學入門≫에 처음 수록 된 처방으로 打撲損傷, 氣血凝結, 胸腹脇痛을 치료한다고 알려져 있고, 이 처방을 구성하는 약재들은 각기 破瘀血, 行血破瘀, 理氣, 淸熱凉血, 活血化瘀, 通血脈하는 약효를 가진 약물들로 조성되어 있다 8 - 10) . 전반적인 藥性은 平溫無毒하고, 味는 辛苦多甘鹹少하고, 歸經은 血과 관계가 깊은 肝, 心, 脾등에 편중되어 있으며 活血祛瘀, 通經活絡, 理氣止痛 등의 효능이 있어 瘀血로 인한 腫痛을 치료한다고 알려져 있다 11 - 13) . 이에 當歸鬚散이 조직간의 出血과 관련된 병증 및 瘀血性 腫痛의 효능이 입증되어, 나아가 外傷性 創傷 治癒에 대한 효과를 객관적으로 입증하고자 실험에 임하였다.
이에 저자는 當歸鬚散이 外傷으로 인한 창상에서의 한의학적인 실험적 연구 결과에 대한 보고가 미흡하여, in vitro 실험으로 lipopolysaccharide(LPS)로 유도 된 Raw 264.7에서 當歸鬚散의 항염증 효능을 관찰하고, in vivo 실험으로 외상성 창상을 유발 시킨 병태모델에 자연치유군, 당귀수산 투여군, 테라마이신 도포군, 당귀수산과 테라마이신 동시 처치군으로 실험군을 나눠 항염증, 창상의 면적, 혈액학적 검사, 유전자 발현 정도 및 조직학적 검사를 통하여 외상성 창상에 대한 당귀수산의 효능을 검증하고자 한다.
재료 및 방법
- 1. 약재
본 실험에 사용한 당귀수산(Danggwisusan 이하 DG로 표기)의 구성 약재들은 ㈜옴니허브에서 구입하였고, 대전대학교 TBRC-RIC에서 정선 후 사용하였다. 그 내용과 분량(1첩)은 다음과 같다( Table 1 ).
The Prescription of DG
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The Prescription of DG
- 2. 동물 및 사료
실험에 사용된 랫은 수컷 6주령의 Wistar Rat (170-200g)을 ㈜라온바이오(Korea)사에서 구입하여 실험하였다. 동물은 2주간의 안정기를 가지면서 순화를 시켰으며, 희생 당일까지 일반 고형사료(㈜퓨리나, Korea)를 공급하고 자유 식이하면서 물을 충분히 공급하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 22 ± 2℃, 1일 중 12시간은 200-300 Lux로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다. 본 실험은 대전대 동물실험윤리 위원회의 승인(동물사용 윤리위원회 승인번호 – DJUARB 2013-027)을 받아 동물윤리준칙에 의거하여 실험하였다. 일반 사료의 ㎏당 조성내용과 분량은 다음과 같다( Table 2 ).
The Components of Normal Diet
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The Components of Normal Diet
- 3. 시약 및 기기
사용된 시약은 dulbecco's modified eagle's medium (DMEM : Gibco BRL Co., U.S.A.), 우태아혈청 (fetal bovine serum: FBS, Invitrogen Co., U.S.A.), lipopolysaccharide (LPS : Sigma Co., U.S.A.), cell viability assay kit (Daeillab sevice, Korea), nitric oxide detection kit (Intron Biotechnology, Korea), penicillin (Hyclone, Co., U.S.A.), mouse cytokine milliplex map immunoassay kit (Millipore Co., U.S.A.), total RNA prep kit (Intronbio., Korea), terramycin(PT. Pfizer., Indonesis)을 사용하였으며, 기기는 rotary vacuum evaporator (Büchi B-480 Co., Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU-540 Co., Japan), ELISA reader (Molecular Devices Co., U.S.A.), Luminex (Millipore Co., U.S.A.), PCR machine (Thermal Dynamic., U.S.A), Digimatic Caliper (Mitutoyo, Japan), 주정추출에 사용 된 주정은 ㈜주정판매월드(Jeonju, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- 4. 시료 추출
DG 2첩에 80% 주정(C 2 H 5 OH) 1000 ㎖을 넣고 3시간 동안 환류추출 후 여과액을 얻어 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하였다. 농축된 용액을 freeze dryer로 동결 건조하여 분말 20.09 g을 얻었으며, 얻어진 분말은 초저온 냉동고(-80℃)에서 보관하면서 실험에 따라 필요한 농도로 증류수에 희석하여 사용하였다.
- 5. 세포독성 측정
Raw 264.7 세포는 96 well plate에 2×10 4 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 새로운 배양액으로 교체하였고, DG를 각각 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10 ㎕의 WST solution을 첨가하여 세포배양기 (37℃, 5% CO 2 )에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 450 ㎚에서 ELISA reader기를 이용해 흡광도의 변화를 측정한 후 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
- 6. 항염증 효능 측정
- 1) Nitric oxide(NO) 측정
NO의 농도는 배양액 내의 nitric oxide 농도를 griess reagent system을 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 세포를 96 well plate에 2×10 4 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양 한 후 새로운 배양액으로 교체하였고 DG를 각각 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도와 LPS 1 ㎍/㎖의 농도를 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. N1 buffer와 N2 buffer를 각각 10분간 반응 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.
- 2) Cytokine 생성량 측정
Raw 264.7 cells을 12 well plates에 2×10 5 cells/㎖이 되도록 분주하고, 24시간 동안 배양한 후, DG를 1, 10, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하고, LPS 1 ㎍/㎖을 처리하였다. 24시간 동안 배양 한 후 세포배양액을 수거하여 배양액에 함유된 IL-1 β , IL-6, TNF- α 를 custom-made 4-plex cytokine Milliplex panel을 이용하여 측정하였다.
- 7. 창상 유발 및 실험군 분류
마취제(졸레틸 0.5 ㎖ + 럼푼 0.1㎖)을 이용하여 Rat를 마취한 후, 배부(背部)의 피부를 깨끗이 제모 한다. 제모 된 피부를 알콜로 깨끗이 소독한 후, 척추를 기준으로 고관절 정중앙에 2 × 2 ㎠ 의 정사각형 크기로 작도한다. 수술용 가위를 이용하여 피부를 근막 위까지 제거하여 창상을 유발하였다. 실험군은 자연치유를 한 Control군, DG만 투여한 DG군, 테라마이신(Oxytetracycline HCL 5mg + Polymaxin B Sulfate 10000 I.U)을 처치한 Terra군, DG를 투여하고 테라마이신을 함께 처치한 DG + Terra군으로 총 4그룹으로 나누고(n=6), 각 케이지에 한 마리씩 수용하였다.
- 8. 약물 처치 및 창상 면적 측정
창상을 유발 한 후, 다음날부터 모든 군은 3주간 자유식이를 하였고, DG군과 DG + Terra군은 DG를 3주간 매일 1회 2㎖ (200㎎/㎏)씩 오전 10시에 경구투여 하였다. Terra군과 DG + Terra군에는 테라마이신을 창상 유발 후 1주 동안은 2일 주기, 유발 후 2주, 3주 동안은 3일 주기로 창상부위에 충분히 도포 하였다. DG투여량은 1첩을 성인 체중 60kg에 1회 투여 용량으로 하고,1첩으로부터 얻은 시료를 마우스 체중 30g으로 기준하여 산출하였다. 창상면적은 유발 후 1일, 4일, 8일, 11일, 15일, 19일, 22일 총 3주간 Digimatic Caliper를 이용하여 측정 평균산출하였다.
- 9. 혈액 내 사이토카인 및 면역세포 측정
실험 종료 후 ether로 마취한 상태에서 심장 천자법을 이용하여 채혈하였다. 전혈 중 일부는 서울의과학연구소에 분석 의뢰하여 총 백혈구, 백혈구 중 호중구, 단핵구, 림프구를 측정하였고, 나머지 전혈은 실온에서 30분간 굳힌 뒤 3,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청을 가지고 IL-1 β , IL-6, TNF- α 는 custom-made 6-plex cytokine Milliplex panel을 이용하여 Luminex로 측정하였다.
- 10. RNA 분리 및 RT-PCR 분석
쥐의 배부 창상피부조직에서 발현된 창상 인자를 측정하기 위해 RT-PCR을 시행하였다. 분리 한 피부조직을 동결시킨 뒤 조직을 파쇄하여 total RNA prep kit을 이용하여 RNA를 추출하였다. 역전사 반응은 추출한 RNA를 RT premix kit의 mixture를 사용하여 first-strand cDNA를 합성하였으며, M-MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 사용하였다. RT-PCR은 DNA polymerase 1U/tube에 250 mM dNTPs mix, RT buffer (10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 30 mM KCl, 1.5 mM MHCl 2 )를 포함한 mixture에 각 샘플과 primer를 넣고 PCR을 시행하였다. MMP-1은 55℃에서 2분, 95℃에서 10분, 60℃에서 15초, MMP-2은 61℃에서 2분, 95℃에서 10분, 60℃에서 15초, MMP-9은 57℃에서 2분, 95℃에서 10분, 60℃에서 15초, GAPDH는 57℃에서 2분, 95℃에서 10분, 60℃에서 15초 동안 각 30 cycles 조건으로 PCR을 수행하였으며, 사용된 primer 는 아래와 같다( Table 3 ). 1% agarose gel에 전기영동 후 유전자발현의 여부를 UV로 촬영하여 각 그룹별로 band를 확인하고, RNA 발현을 나타내었다.
The sequences of primers in used this study.
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The sequences of primers in used this study.
- 11. 조직 처리 및 H&E 염색
실험 종료 후, 각 실험군 별로 적출한 창상 피부조직을 10% 중성 포르말린에 48시간 고정하여 고정이 완료된 조직들을 흐르는 수돗물에서 12시간 수세한 뒤 조직 내 고정액을 완전 제거하였다. 조직의 탈수를 위해 60%에서부터 100% 알코올에 이르기까지 농도 상승 순으로 탈수하고, xylene에 투명과정을 거친 다음 파라핀 블럭을 제작하였다. 제작된 블럭은 박절기 (microtome)를 이용해 3∼4 ㎛ 두께로 절편을 만들어 탈 파라핀 및 함수과정을 거친 다음 hematoxyline과 eosin (H&E) 염색을 실시하여 광학현미경상에서 관찰 및 사진 촬영 하였다.
- 12. 통계처리
실험 결과는 실험 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's T-test 및 ANOVA test를 사용하여 통계처리 하였으며 p ˂ 0.05, p ˂ 0.01 및 p ˂ 0.001 수준에서 유의성을 검정하였다.
결 과
- 1. 세포 독성
RAW 264.7 세포의 세포 생존율을 측정한 결과, 대조군을 100.0 ± 1.0%로 나타냈을 때, DG 투여군 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 105.5 ± 3.1%, 98.4 ± 3.5%, 93.4 ± 2.1%의 세포 생존율을 나타내었다( Fig. 1 ).
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Cell viability of DG extract in Raw 264.7 cells. The results were expressed as mean ± S.D.
- 2. 항염증 효능에 미치는 영향
- 1) Total Nitric oxide(NO) 생성에 미치는 영향
DG 투여군의 NO 생성량은 대조군을 100 ± 2.7%로 나타냈을 때, 정상군은 36.8 ± 2.6%, DG 투여군은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 95.7 ± 1.2%, 93.7 ± 1.1%, 86.1 ± 2.5%로 나타나, 농도의존적인 감소와 100 ㎍/㎖ 농도에서 유의성 있는 ( ** p ˂ 0.01) 감소를 나타내었다 ( Fig. 2 ).
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Effects of DG extract on NO production in LPS-stimulated Raw 264.7 cells. Cells were treated with LPS (1 ㎍/㎖) and 1, 10, 100 (㎍/㎖) of DG for 24 hours. The results are expressed as mean ± S.D (Significance of results, ** p ˂ 0.01).
- 2) IL-1β 생성에 미치는 영향
DG의 IL-1 β 생성량을 측정한 결과, 대조군이 36.9 ± 2.1 pg/㎖, 정상군이 13.2 ± 1.2 pg/㎖, DG 투여군은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 30.2 ± 2.2 pg/㎖, 22.0 ± 2.4 pg/㎖, 19.6 ± 1.6 pg/㎖로 나타나, 대조군에 비해 모든 농도에서 농도 의존적이며 유의성( * p ˂ 0.05, ** : p ˂ 0.01, *** : p ˂ 0.001) 있는 감소를 나타내었다( Fig. 3 ).
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Effects of DG extract on LPS-stimulated IL-1β production in Raw 264.7 cells. Cells were treated with LPS (1 ㎍/㎖) and 1, 10, 100 (㎍/㎖) of DG for 24 hours. The results are expressed as mean ± S.D (Significance of results, * p ˂ 0.05, ** p ˂ 0.01, *** p ˂ 0.001).
- 3) IL-6 생성에 미치는 영향
DG의 IL-6 생성량을 측정한 결과, 대조군이 8779.2 ± 651.1 pg/㎖, 정상군이 2.8±1.6 pg/㎖, DG 투여군은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 3626.2 ± 382.3 pg/㎖, 4851.0 ± 610.4 pg/㎖, 4727.7 ± 449.7 pg/㎖로 나타나, 대조군에 비해 모든 농도에서 농도 의존적이며 유의성( ** : p ˂ 0.01, *** : p ˂ 0.001) 있는 감소를 나타내었다( Fig. 4 ).
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Effects of DG extract on LPS-stimulated IL-6 production in Raw 264.7 cells. Cells were treated with LPS (1 ㎍/㎖) and 1, 10, 100 (㎍/㎖) of DG for 24 hours. The results are expressed as mean ± S.D(Significance of results, ** p ˂ 0.01, *** p ˂ 0.001).
- 4) TNF-α 생성에 미치는 영향
DG의 TNF- α 생성량을 측정한 결과, 대조군이 1686.0 ± 198.4 pg/㎖, 정상군이 251.6±33.7 pg/㎖, DG 투여군은 1, 10, 100 (㎍/㎖) 농도에서 1375.1 ± 88.6 pg/㎖, 1341.7 ± 92.2 pg/㎖, 1004.5 ± 127.8 pg/㎖로 나타나, 대조군에 비해 모든 농도에서 농도 의존적이며 유의성( * : p ˂ 0.05, ** : p ˂ 0.01) 있는 감소를 나타내었다( Fig. 5 ).
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Effects of DG extract on LPS-stimulated TNF-α production in Raw 264.7 cells. Cells were treated with LPS (1 ㎍/㎖) and 1, 10, 100 (㎍/㎖) of DG for 24 hours. The results are expressed as mean ± S.D (Significance of results, * p ˂ 0.05, ** p ˂ 0.01).
- 3. 창상 치유에 미치는 영향
실험 종료 후 창상 면적을 측정한 결과, Control군은 80%, DG 투여군은 93%, Terra 투여군은 92%, DG + Terra 투여군은 94%의 감소를 나타내었고, DG, Terra, DG + Terra 투여군에서 각각 10일, 14일, 17일, 21일째 유의성 있는( * p ˂ 0.05, ** p ˂ 0.01, *** p ˂ 0.001) 감소를 나타내었다( Table 3 , Fig. 6A, B -).
The change of wound size in DG extract and terramycin groups.
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The change of wound size in DG extract and terramycin groups.
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The change of wound size in DG extract and terramycin groups. The results were expressed as mean ± S.D.(n=6). (Significance of results, * p ˂ 0.05, ** p ˂ 0.01, *** p ˂ 0.001).
- 4. 혈액 내 사이토카인 및 면역세포에 미치는 영향
- 1) IL-1β 생성에 미치는 영향
혈액 내 IL-1 β 생성량을 측정한 결과, Control군이 106.0 ± 9.7 pg/㎖, DG군이 89.1 ± 9.5 pg/㎖, Terra군이 85.3 ± 9.8 pg/㎖, DG + Terra군이 83.7 ± 9.9 pg/㎖로 나타났고, Terra군과 DG + Terra군에서 유의성 ( * : p ˂ 0.05) 있는 감소를 나타내었다(Fig. 7).
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Effects of DG extract and terramycin on levels of IL-1β in the blood of wound-induced Rats. The results are expressed as mean ± S.D.(n=6). (Significance of results, * p ˂ 0.05).
- 2) IL-6 생성에 미치는 영향
혈액 내 IL-6 생성량을 측정한 결과, Control군이 916.3 ± 137.7 pg/㎖, DG군이 871.7 ± 67.2 pg/㎖, Terra군이 812.2 ± 69.1 pg/㎖, DG + Terra군이 805.5 ± 61.0 pg/㎖로 나타났고, Terra군과 DG + Terra군에서 유의성 ( * : p ˂ 0.05) 있는 감소를 나타내었다( Fig. 8 ).
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Effects of DG extract and terramycin on levels of IL-6 in the blood of wound-induced Rats. The results are expressed as mean ± S.D.(n=6). (Significance of results, * p ˂ 0.05).
- 3) TNF-α 생성에 미치는 영향
혈액 내 TNF- α 생성량을 측정한 결과, Control군이 66.4 ± 11.1 pg/㎖, DG군이 50.4 ± 9.6 pg/㎖, Terra군이 47.3 ± 6.7 pg/㎖, DG + Terra군이 45.2 ± 6.1 pg/㎖로 나타났고, 모든 군에서에서 유의성 ( ** : p ˂ 0.01, *** : p ˂ 0.001) 있는 감소를 나타내었다( Fig. 9 ).
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Effects of DG extract and terramycin on levels of TNF-α in the blood of wound-induced Rats. The results are expressed as mean ± S.D.(n=6). (Significance of results, ** : p ˂ 0.01, *** : p ˂ 0.001).
- 4) 총 백혈구 생성에 미치는 영향
혈액 내의 총 백혈구 생성량은 Control군이 11.78 ± 1.29 Thous/uL, DG군이 5.98 ± 1.85 Thous/uL, Terra군이 9.73 ± 2.15 Thous/uL, DG + Terra군이 6.13 ± 1.32 Thous/uL로 나타나, DG군과 DG + Terra군에서 유의성 있는( ** p ˂ 0.01) 감소를 나타내었다( Fig. 10 ).
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Effects of DG extract and terramycin on levels of WBC in the blood of wound-induced Rats. The results are expressed as mean ± S.D.(n=6). (Significance of results, ** : p ˂ 0.01).
- 5) 호중구 생성에 미치는 영향
혈액 내 백혈구에 대한 호중구의 비율은 Control군이 2.80 ± 1.01%, DG군이 2.28 ± 0.55%, Terra군이 2.97 ± 0.19%, DG + Terra군이 1.87 ± 0.46 %로 나타나, DG군과 DG + Terra군에서는 감소를 나타내었으나 유의성은 없었다( Fig. 11 ).
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Effects of DG extract and terramycin on levels of neutrophi in the blood of wound-induced Rats. The results are expressed as mean ± S.D.(n=6).
- 6) 림프구 생성에 미치는 영향
혈액 내 백혈구에 대한 림프구의 비율은 Control군이 90.20 ± 8.72%, DG군이 95.43 ± 1.24%, Terra군이 93.38 ± 3.20%, DG + Terra군이 97.77 ± 0.77 %로 나타나, 모든 군에서 큰 차이를 보이지는 않았다( Fig. 12 ).
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Effects of DG extract and terramycin on levels of lymphocyte in the blood of wound-induced Rats. The results are expressed as mean ± S.D.(n=6).
- 7) 단핵구 생성에 미치는 영향
혈액 내 백혈구에 대한 단핵구의 비율은 Control군이 1.45 ± 0.61%, DG군이 0.30 ± 0.14%, Terra군이 0.30 ± 0.19%, DG + Terra군이 0.25 ± 0.11 %로 나타나, 모든 군에서 유의성 있는( * p ˂ 0.05) 감소를 나타내었다( Fig. 13 ).
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Effects of DG extract and terramycin on levels of monocyte in the blood of wound-induced Rats. The results are expressed as mean ± S.D.(n=6). (Significance of results, * : p ˂ 0.05).
- 5. 유전자 발현에 미치는 영향
창상 피부조직에서의 MMP-1, 2, 9 발현양을 측정한 결과, DG, Terra, DG + Terra 모든 군이 Control군에 비해 모두 감소를 나타내었고, MMP-1에서는 Terra군, MMP-2에서는 DG, Terra, DG + Terra군, MMP-9에서는 DG + Terra군에서 유의성 ( * p ˂ 0.05, ** p ˂ 0.01)있는 감소를 나타내었다( Fig. 14 ).
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Effects of DG extract and terramycin MMP-1, 2, 9 gene expression in wound tissue. The results are expressed as mean ± S.D.(n=6). (Significance of results, * : p ˂ 0.05, ** : p ˂ 0.01).
- 6. 조직병리학적 관찰
창상 피부조직을 Hematoxylin & Eosin 염색하여 관찰한 결과, Control군에서는 콜라겐의 증착과 피부의 재 상피화가 두텁게 일어났으며, 만성염증이 나타났다. DG, Terra, DG + Terra 모든 투여군에서 콜라겐의 증착과 만성염증이 감소함을 나타내었고, 피부의 재 상피화 역시 DG, Terra, DG + Terra 투여군 모두에서 감소하고, 색이 옅어지며, 혈관의 재형성이 나타났다( Fig. 15 ).
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Histopathological findings of wound tissue section on DG extract and terramycin treated in wound-induced Rats.
고 찰
창상은 외부의 물리적 요인에 의해 조직이 손상을 받아 세포학적 또는 해부학적 연속성이 파괴된 상태이며, 炎症期, 上皮化期, 增殖期, 成熟期 크게 네 단계의 치유과정으로 구분하나 명확한 시기와 순서가 정해져 있지 않고 서로 중첩되어 연속적으로 진행된다. 창상 치유는 외상에 대한 인체 내 조직반응을 수반하는 복구과정이며, 재상피화, 창상수축, 유아조직형성 및 교원질 합성 등 여러 과정을 지나 조직을 회복시키는 복잡한 생물학적 과정이다. 이러한 과정은 동시에 이루어지며, 반흔을 형성하거나, 조직의 재생을 유도하여 창상면적이 감소된다 14 , 15) .
창상 치유과정은 콜라겐 및 비콜라겐성 물질들의 침착뿐 아니라 matrix metalloproteinases(MMPs) 와 tissue inhibitors of metalloproteinases(TIMPs)에 의한 세포외기질(extracellular matrix)의 개형이 필요하다 1 , 16) . 이러한 4단계 중 중요한 시기를 염증기와 증식기로 볼 수 있으며, 염증단계에는 호중구 및 대식구, 증식단계에는 섬유아세포가 중요한 역할을 하는데, 섬유아세포는 collagen tenascin, fibronectin 및 많은 proteoglycans를 분비하며 육아조직을 형성하게 된다. 이때 창상 기질은 섬유아세포 및 염증세포에서 분비되는 MMPs에 의해 파괴된다. 그리고 개형단계에 이르러 MMPs와 TIMPs에 의해 세포 양과 혈류양이 감소하면서 치유가 완성 된다 17 , 18) .
본 실험에 앞서 DG 시료의 안전성을 확인하고자 마우스 유래 대식 세포주인 Raw 264.7 세포를 대상으로 하여 시료의 독성을 확인 한 바 안전성이 확인되었다.
염증반응은 조직 손상에 대해 반응하는 능동적인 과정으로 생체의 조직이나 세포가 어떤 원인에 의해 손상을 받게되면 이에 대한 반응을 함으로써 손상된 부위를 극소화 시키고 복구시키려는 국소적 반응이다 1) .
염증기의 초기와 후기에는 호중구(netrophil)와 단핵구(monocyte)가 많이 나타나는데, 호중구는 세균과 상처 내 손상된 기질을 탐식하여 죽은 조직을 제거하는 역할(debridement)을 담당하고. 단핵구는 조직에서 대식세포로 바뀌고 이런 대식세포는 여러 성장인자들을 분해하여 혈관신생과 육아조직 생성을 이끌어 염증단계에서 재생으로 넘어가는 아주 중요한 가교역할을 한다 19) . 증식기에는 피부의 상피가 다시 만들어지면서 신생혈관이 형성되고 섬유형성으로 손상된 피부조직이 재생된다. 섬유모세포는 상처 부위로 이동하며 증식하면서 새로운 교원질과 기질단백질을 형성하여 육아조직이 만들어지는데, 이때 collagen, proteoglycan, elastin이 포함된 기질을 형성하게 된다 20 , 21) . 또한 혈관확장이 혈관신생에 필수적이며, 창상치유초기에는 혈관투과성이 증가하는데 산화질소(NO)는 혈관신생 및 염증반응에 관여함으로써 긍정적인 역할을 한다 15) . NO는 인체에서 다양한 생리활성을 나타내는 인자이기도 하지만 과다 생산되면 활성 산소와 결합하여, 과산화 질소 등의 다른 독성 유리기 물질을 만들어 내어 염증질환을 유발시키거나 악화시키는 인자로 작용한다 22) .
그람-음성균의 세포 외막에 존재하는 내독소 중의 하나인 lipopolysaccharide(LPS)는 Raw 264.7과 같은 macrophage와 monocyte에서 interleukin-1 β (IL-1 β ), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor- α (TNF- α )와 같은 염증성 cytokine의 분비를 촉진하며 iNOS의 발현을 유도하여 NO를 생성한다고 알려져 있다 22 , 23) .
IL-1 β 는 외부 항원을 감지한 대식세포에서 분비하는 비특이 염증반응을 개시하는 초기 면역반응 물질로써 LPS나 TNF- α 와 같은 다른 사이토카인에 의해 유도가 되며, 대식세포, 호중구 등에 의해 생산이 되는 염증 유발 사이토카인이다. IL-6는 염증반응 시 분비되는 친염증성 사이토카인으로 단핵구나 대식세포에서 분비되며 림프구를 활성화시켜 항체생산을 증가시키는 것으로, 염증성 병변에서 항상 증가하는 것으로 보고되고 있으며, TNF- α 는 T cell과 대식세포를 활성화하고 다른 pro-inflammatory cytokine들을 증가시켜서 염증반응을 일으키는데 중요한 역할을 한다. 주로 활성화된 대식세포에서 대량 생산되지만, 림포이드계의 세포(lymphoid cells), 비만세포(mast cells), 내피세포(endothelial cells)을 비롯하여 생체에 존재하는 다양한 세포에서도 생산된다. 또한, 면역 세포들의 집합과 면역 매개 물질들의 생산을 자극하는데 중요한 역할을 담당하며, 인체 내의 미생물들을 포식하는 대식 세포의 능력을 증진시키고 육아종(granuloma)을 형성하는 등, 숙주의 방어 기전에 있어서도 핵심적인 역할을 수행한다 23 - 25) .
이에 DG가 in vitro 실험에서 LPS로 유도한 Raw 264.7 세포에서의 NO, IL-1 β , IL-6, TNF- α 생성에 미치는 영향과 in vivo 실험에서 혈청에서의 IL-1 β , IL-6, TNF- α 생성에 미치는 영향을 측정 한 결과, 모두 농도 의존적인 감소와 더불어 유의성( * p ˂ 0.05, ** p ˂ 0.01, *** p ˂ 0.001) 있는 감소를 나타내어 항염증에 효능이 있음을 나타내었다.
앞선 연구에 따르면 전층 창상이 치유되는 과정은 기전상으로 창상 수축과 창상 변연의 기저세포가 창상부로 이동하는 창상 상피화를 통해 치유되므로, 전체적인 창상 치유의 정도는 창상 수출율과 창상 상피화율의 합으로 수식화 하여 나타냄으로 효능을 입을 할 수 있다고 알려져 있다 26) . 본 연구에서도 DG, Terra, DG + Terra 투여군에서 10일 이후부터 유의성( ** p ˂ 0.01, *** p ˂ 0.001) 있는 면적 감소 효과를 나타내었다.
기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinases, MMP)는 각 특이성에 따라 20여종으로 분류되고, 그 특성은 세포외 기질의 여러 가지 단백질을 분해하며, 기질 금속단백분해효소 조직억제제(tissue-darived inhibitor of MMPs, TIMP)에 의해 억제된다. MMP는 조직회복, 혈관생성, 조직의 발생과정에서 형태를 형성하는데 중요하며, 섬유모세포, 각질세포, 호중구성백혈구, 대식세포에서 분비가 된다. 창상 치유의 과정 중 그 활성이 조절 받게 되면 조절기전이 파괴되어 만성창상 등의 병적인 상태가 지속되며, 특히 켈로이드와 비후성 반흔에서 증가된 콜라겐 축적은 MMP-1, 9 mRNA와 밀접한 연관이 있다고 보고되었다 27 , 28) . 선행 연구에 따르면 급성 창상기에는 MMP-1, 2, 9 mRNA가 급격히 증가하고, 창상 회복기나 육아 형성 및 재형성 단계에는 점차 줄어든다고 하였고, 만성창상에서는 MMP-2, 9 mRNA가 지속적으로 높은 농도로 나타나며, 이는 육아조직 형성 부족을 야기한다고 보고하였다 29 , 30) . 본 실험에서 MMP-1, 2, 9 mRNA의 발현양은 자연치유군에 비해 DG, Terra, DG + Terra 투여군 모두 감소을 나타내어, 선행 연구와 비교, 부합되는 결과가 나타나, 창상 치유와 육아조직의 재형성이 잘 이루어지고 있다고 추측할 수 있다.
창상 피부조직을 Hematoxylin & Eosin 염색하여 관찰한 결과, control군에서는 콜라겐의 증착과 피부의 재상피화가 두텁게 일어나고 만성염증이 생겼으나, DG, Terra, DG + Terra 투여군 모두 콜라겐의 증착과 만성염증의 감소를 나타냈었고, 또한 피부의 재상피화가 감소하며, 색이 옅어졌다. 이는 DG가 콜라겐의 증착과 만성염증 및 피부 재상피화를 감소시켜 병리조직학적으로 창상 치유에 도움이 된다고 판단된다.
결 론
본 연구는 DG의 외상성 창상의 회복능력에 미치는 효능을 객관적으로 검증하고자 실험을 통하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
  • 1. 세포 독성평가에서는 93% 이상의 세포 생존율을 나타내어 안정성이 확인되었다.
  • 2. DG의 항염증 효능은 in vitro 실험에서 NO 생성 저해능과 IL-1β, IL-6, TNF-α소거능, 그리고 in vivo 실험에서 혈청 내의 IL-1β, IL-6, TNF-α소거능 모두 농도 의존적인 감소와 유의적인 결과가 도출되었다.
  • 3. 창상면적은 자연치유군에 비해 DG, Terra, DG + Terra 투여군에서 10일, 14일, 17일, 21일째 유의적인 감소 결과가 도출되었다.
  • 4. 혈액 검사에서 총 백혈구는 DG, DG + Terra 투여군에서, 단핵구는 DG, Terra, DG + Terra 투여군에서 유의적인 감소 결과를 나타내었고, 호중구에서는 DG, DG + Terra 투여군에서 감소하였지만 유의성은 없는 결과를 도출하였다.
  • 5. MMP-1, 2, 9 mRNA 발현에서는 DG, Terra, DG + Terra 투여군 모두 감소를 나타내었고, MMP-1에서는 DG 투여군, MMP-2에서는 DG, Terra, DG + Terra 투여군, MMP-9에서는 DG + Terra 투여군에서 유의적인 결과가 도출되었다.
  • 6. 병리조직학적 검사상 DG, Terra, DG + Terra 투여군 모두 콜라겐의 증착과 만성염증의 감소를 나타냈었고, 또한 피부의 재상피화가 감소하며, 색이 옅어지는 결과를 도출하였다.
이상의 외상성 창상에 대한 실험으로, DG, Terra, DG + Terra 투여군이 in vitro, in vivo 에서 단독 치료보다는 병행치료 시 유의한 결과가 도출되었음을 실험적으로 입증되었으며, 향 후 많은 피부 병증에 대한 한방과 양방의 병행 치료에 대하여 심도 깊은 연구가 필요하다고 사료된다.
Acknowledgements
본 연구는 산업통상자원부 지정 대전대학교 난치성 면역질환의 동서생명 의학연구 지역혁신 센터의 지원에 의한 것입니다.
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