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Molecular Authentication of Pinelliae Tuber from its adulterants by the analysis of DNA barcodes, matK and rbcL genes
Molecular Authentication of Pinelliae Tuber from its adulterants by the analysis of DNA barcodes, matK and rbcL genes
The Korea Journal of Herbology. 2013. Nov, 28(6): 53-58
Copyright © 2013, The Korea Association Of Herbology
  • Received : October 23, 2013
  • Accepted : November 08, 2013
  • Published : November 30, 2013
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영미 이
leeym1227@kiom.re.kr
병철 문
윤의 지
욱진 김
호경 김
hkkim@kiom.re.kr

Abstract
Objectives :
Pinelliae Tuber has been used as a typical unauthentic herbal medicines. Due to the morphological similarity between Pinelliae Tuber and adulterants, the correct authentication is very difficult. Therefore, we introduced DNA barcode to establish a powerful tool for the authentication of Pinelliae Tuner from adulterants.
Methods :
To obtain DNA barcode regions, genomic DNA was extracted from nineteen specimens of Pinellia ternata , Pinellia pedatisecta , Pinellia tripartita , and Typhonium flagelliforme , and mat K and rbc L genes were amplified. For identification of species specific sequences and analysis phylogenetic relationship, a comparative analysis were performed by the ClastalW and UPGMA based on entire sequences of mat K and rbc L genes, respectively.
Results :
In comparison of two DNA barcode sequences, we elucidated the phylogenetic relationship showing distinct four groups depending on species and identified 40 and 20 species specific nucleotides enough to distinguish each species from mat K and rbc L gene, respectively. The sequence differences at the corresponding positions were avaliable genetic marker nulceotides to discriminate the correct species among analyzed four species. These results indicated that phylogentic and comparative analysis of mat K and rbc L genes are useful genetic markers to authenticate Pinelliae Tubers.
Conclusions :
The marker nucleotides enough to distinguish P. ternata , P. tripatrita , P. peditisecta , and T. flagelliform , were observed at 40 positions in mat K gene and 20 positions in rbc L gene sequence, respectively. These differences can be used to authenticate Pinelliae Tuber from adulterants as well as discriminate each four species.
Keywords
서 론
半夏는 우리나라에서 다빈도로 사용되는 약재중 하나로 한의학에서는 화담지구(化痰止嘔), 조습강역(燥濕降逆) 그리고 소비산결(消痞散結) 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다 1) . 半夏의 기원식물인 반하 Pinellia ternata (Thunb.) Makino는 천남성(天南星)과에 속하는 다년생 식물로서 한국, 중국, 일본 등 극동아시아의 난‧온대지역에 한정적으로 분포하는 것으로 알려져 있는 대표적인 약용식물 중 하나이다 2) . 대한민국약전에 의하면 한약재 半夏는 반하 Pinellia ternata 의 덩이줄기로서 주피를 완전히 제거한 것으로 규정되어 있다 3) . 그러나 중국에서는 기원이 다른 호장남성 Pinellia pedatisecta Schott이 재배되어 半夏로 유통되고 있을 뿐 만 아니라, 광동성, 광서성, 운남성, 사천성 등에서 속이 다른 수반하 Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume, 이명 Arum falgelliforme Lodd.가 재배되어 半夏로 유통되고 있는 실정이다. 또한 국내에서는 같은 속 대반하 Pinellia tripartita (Blume) Schott가 수집 또는 재배되어 반하로 유통될 가능성을 가지고 있어 半夏의 기원정립과 위품 감별을 위한 체계적인 연구가 시급한 실정이다.
半夏와 유사 한약재로 사용되는 이들 식물의 덩이줄기는 다양한 방법을 이용하여 이들을 감별하기 위한 연구가 진행되어 왔다. Choi 등의 연구에 의하면 반하 P. ternata 와 수반하 T. flagelliforme , 천남성 A. yunnanense 은 덩이줄기 구의 크기 및 외부 형태로 감별이 가능한 것으로 알려져 있으나 4) , 분말(粉末) 혹은 절편(切片)하여 유통 시킬 경우 외형만으로 위품을 감별하기에 어려움이 있어, 이러한 단점을 보완하기 위한 방법으로 분자 생물학적 기법이 제안되기도 하였다 5) . 半夏를 감별하기 위한 분자 생물학적 연구로 Randomly Amplified polymorphic DNA(RAPD)를 이용한 PCR-RFLP 기법이 개발되었지만 국내산과 중국산 유통 半夏의 감별에 국한되어 있으며, Liu 와 Guo (2010)가 보고한 Polymerase Chain Reaction(PCR)을 통한 allele-specific 감별 기법 또한 반하와 천남성 A. yunnanense 의 감별에 국한되어 있어 반하류에 대한 명확한 감별이 어려운 실정이다 5 , 6) . 이에 半夏와 이들의 위품으로 유통되고 있는 호장남성, 수반하와 유통될 가능성이 있는 대반하에 대한 보다 효율적인 분자생물학적 감별법 개발이 요구되고 있다.
최근 분자생물학의 발전과 염기서열 분석기술의 발달로 유전자 분석을 통한 식물 분류 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 국제생물바코드 컨소시엄 (CBLO, Consortium of Barcoding of Life)은 식물의 특정 유전자 부위의 염기서열정보로 이루어진 DNA 바코드를 이용하여 종의 판별 및 분자계통학적 연구가 가능한 것을 보고하고 있다 7) . DNA 바코드로 이용되는 대표적인 유전자 부위로 핵의 리보솜 RNA 유전자(Nuclear Ribosomal RNA gene, rDNA)에 존재하는 Internal Transcribed Spacer( ITS ) 부위, mat K, rbc L, psb A- trn H 유전자 등이 식물 종 판별을 위한 유전자 후보로 제시하고 있으며, 이들 유전자를 이용한 객관적인 식물 분류체계 확립 및 종간 유연관계 분석을 위한 분자계통학적 연구가 활발히 진행되고 있다 8 , 9) .
본 논문에서는 半夏, P. ternata 와 半夏의 위품으로 유통 될 가능성이 있는 호장남성 P. peditisecta , 수반하 T. flagelliforme , 대반하 P. tripatrita 를 국내 및 중국의 다양한 자생지에서 수집하여 mat K, rbc L 두 유전자의 염기서열 정보 분석을 통해 半夏와 그 위품을 명확하게 감별 할 수 있는 DNA marker nucleotide를 발굴하여 분자마커로 활용하고 혼‧오용 방지를 위한 자료를 제공하고자 하였다.
재료 및 방법
- 1. 실험 재료
본 실험에 이용된 시료는 제주, 경상남도, 전라남도, 전라북도, 충청남도 등의 국내 자생지에서 수집하였고 국외의 경우 중국 하남성, 감숙성, 호남성, 귀주성, 광서성, 사천성 등지의 각각 다른 자생지와 재배지에서 수집하여 반하 5개, 대반하 4개, 호장남성 6개, 수반하 4개의 시료를 분석에 이용하였다( Table 1 ). 수집한 시료는 본초학, 생약학, 식물분류학 등의 전문가로 구성된 분류‧동정 자문회의 동정을 거쳐 그 종을 최종 확정지어 사용하였으며, 각 시료의 기원식물은 압착 표본을 제작하여 한국한의학연구원 한약표준표본관(KHSHR)에 표본번호를 부여하여 보관하였다.
Information of Plant Materials Used in This Study.
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- 2. DNA 추출
-70℃의 초저온 냉동고에 보관된 국내‧외 자생지 또는 재배지에서 수집한 기원식물 생체시료는 액체질소로 급냉 시켜 막자와 사발을 이용하여 분말상태로 마쇄한 후, DNasey Plant Mini Kit(QIAGEN, CA, USA)을 이용하여 DNA를 추출‧정제하였다. 정제된 DNA는 1.5% agarose gel 상에 전기영동 후, Ethidium Bromide(EtBr)로 염색하여 UV light에서 DNA 절편을 확인하였으며, UV spectrophotometer(Nanodrop ND-1000, DE, USA)를 이용하여 260 nm와 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량 하였다.
- 3. matK, racL 유전자 부위의 PCR 증폭 및 염기서열 분석
약 20 ng의 total DNA를 주형으로 각 10 pmole의 정방향, 역방향 primer( Table 2 ) 및 2×PCR pre-mix(Solgent, Daejeon, Korea)를 최종 30 ㎕의 반응용액에 첨가하여, DNA Engine Dyad Thermal Cycler(Bio-rad, CA, USA)에서 95℃에서 5분간 predenaturation 한 후, 95℃에서 30초 denaturation, 55℃에서 30초 annealing, 72℃에서 1분 extention을 35회 수행하고 72℃에서 10분간 extention 시켰다. 반응이 끝난 증폭산물은 1.5% agarose gel 상에서 증폭 여부를 확인하였고 단일 DNA 절편으로 확인된 증폭산물은 Gel extraction kit(QIAGEN, CA, USA)을 이용하여 정제 후 pGEM-Teasy vector(Promega, WI, USA)에 삽입하였다. 삽입된 증폭 산물은 XL1-Blue MRF' competent cell(Stratagene, CA, USA)에 형질 전환하여 각 시료별 3개의 colony를 선발하였으며 T7과 SP6 primer 부위로부터 ABI3730 automatic DNA sequencer(Applied Biosystems, CA, USA)를 이용하여 분석된 염기서열을 시료의 표준 염기서열로 선정하여 DNA 바코드 분석에 이용하였다.
The Gene and Primer Sequence Information of DNA Barcodes Used in This Study.
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The Gene and Primer Sequence Information of DNA Barcodes Used in This Study.
- 4. marker nucleotide 탐색 및 계통학적 분석
각 시료의 염기서열은 BioEdit Sequence Alignment Editor(Tom Hall Ibis Biosciences, CA, USA)를 이용하여 편집하였고 ClustalW Multiple alignment로 정렬하여 12) 삽입/결실과 치환의 비교‧분석을 통하여 종 구분이 가능한 DNA 바코드를 탐색하였다. 또한 정렬된 염기서열은 CLC Main workbench(CLC bio, Aarhus, Denmark)의 Maximum Likelihood Phylogeny를 이용하여 Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean(UPGMA) 방식으로 phylogenetic tree를 작성하고 종별 유전적 근연관계를 분석하였다.
결 과
- 1. matK, rbcL 유전자 부위의 PCR 증폭
반하류에 감별을 위하여 mat K 유전자 부위를 PCR 증폭결과, 4종의 시료에서 모두 단일 절편으로 증폭되었고 염기서열의 크기는 반하 P. ternata , 대반하 P. tripartita , 호장남성 P. pedatisecta 의 염기서열 크기는 1,286 bp의 같은 크기로 증폭된 반면 수반하는 1,292 bp로 다른 3종과 크기에서 차이를 보였다. 분석된 염기서열의 G+C(%) 염기 조성 비율은 호장남성 P. pedatisecta 의 PPE-1, 3, 6 시료에서 31.42%로 가장 낮게 나타났으며, 수반하 T. flagelliforme AFL-2, 4 시료에서 32.04%로 가장 높게 나타났다( Table 3 ). rbc L 유전자 부위에 대하여 염기 서열을 분석한 결과, 4종 19개 시료에서 1,517 bp 크기의 단일 절편으로 증폭되었음을 확인 할 수 있었다. G+C(%) 염기 조성 비율은 반하 PPE-4 시료에서 42.45%로 가장 낮았고 수반하 AFL-4 시료에서 42.98%의 가장 높았다( Table 3 ). 두 유전자 부위의 G+C(%) 염기 조성 비율을 비교하였을 경우 mat K 유전자는 약 31.5-32%인 반면, rbc L 유전자는 약 42.5-43%로 높게 나타났다.
Sequence Length and Base Composition of thematK andrbcL Gene among 19 Specimens of 4 Species.
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Sequence Length and Base Composition of the matK and rbcL Gene among 19 Specimens of 4 Species.
- 2. 종 감별을 위한 marker nucleotide 탐색
- 1) matK 유전자 부위 marker nucleotide 탐색
4종의 반하류에 대한 mat K 유전자 부위의 PCR 증폭된 염기서열을 바탕으로 반하, 대반하, 호장남성, 수반하 각 종을 구별할 수 있는 종 특이 염기서열을 확인하기 위하여 지역‧종별 비교를 통하여 삽입/결실 및 염기치환을 확인하였다. mat K 유전자 염기서열의 삽입/결실이나 치환을 분석한 결과, 종내 개체간 변이를 제외하고 총 39 개의 염기 부위에서 염기 치환이 발견되었다. 반하의 염기서열 순서를 기준으로 염기서열 781번(C↔T), 964번(T↔G), 1,203번(G↔A)에서 다른 3종으로부터 반하를 구별할 수 있는 염기 치환이 확인 되었고, 대반하 213번(C↔A), 309번(T↔G), 392번(T↔G), 954번(C↔T), 1,131번(A↔C), 1,186번(C↔T) 6개의 위치에서 특이적으로 염기 치환이 확인되어 대반하와 다른 3종이 구별 되었다. 호장남성 501번(A↔G), 970번(T↔G)에서 염기치환이 확인 되었고 186번(C↔A), 192번(T↔G), 246번(G↔A), 304번(T↔A), 333번(G↔A), 335번(G↔A), 346번(T↔A), 348번(T↔G), 411번(A↔T), 463번(G↔A), 544번(T↔C), 552번(C↔T), 570번(C↔T), 604번(A↔G), 608∼610번(CGT↔TAA), 714번(T↔C), 726번(C↔A), 784번(A↔G), 788번(A↔G), 863번(A↔C), 998번(G↔A), 1,022번(T↔C), 1,048번(G↔A), 1,080번(G↔A), 1,120번(T↔A), 1,156번(G↔A), 1,176번(T↔A), 1,254번(A↔G) 28개의 위치에서 염기 치환이 확인되어 수반하에서 가장 높은 빈도로 염기 치환이 발생하였음을 확인할 수 있었다. 또한 수반하 893∼899번 염기 부위에서 TACACA 6개 염기서열의 삽입이 나타나 반하 3개, 대반하 6개, 호장남성 2개, 수반하 29개의 염기치환과 수반하 1개의 삽입을 포함하여 총 40개의 염기서열 위치에서 4종을 구별할 수 있는 marker nucleotide를 확인할 수 있었다( Table 4 ).
Summary of Species Specific Marker Nucleotides Bbased on thematK Gene.
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T. flagelliforme species specific nucleotide position.
- 2) rbcL 유전자 부위 marker nucleotide 탐색
반하류 4종 19개 시료에서 증폭한 rac L 유전자 부위 염기서열의 삽입/결실이나 치환을 분석한 결과, 종내변이를 제외한 반하 68번(A↔C), 673번(C↔A), 677번(T↔A), 753번(G↔C), 784번(A↔G), 1,391번(C↔A) 6개의 위치에서 다른 3종으로부터 반하의 구별이 가능한 종 특이적 염기 치환을 확인 할 수 있었다. 또한 651번(C↔T), 1,445번(T↔C) 위치에서 대반하 특이 염기 치환이 확인 되었고, 265번(C↔G) 위치에서 호장남성을 다른 3종과 구별 가능한 염기 치환이 확인되었다. 수반하는 498번(G↔T), 585번(G↔T), 759번(G↔A), 807번(C↔T), 813번(C↔A), 825번(C↔T), 983번(G↔C), 1,245번(A↔T), 1,284번(A↔G), 1,338번(G↔T), 1,364번(T↔C), 1,423번(T↔C) 12개의 위치에서 종 구별이 가능한 염기 치환이 관찰되었으며, 분석한 다른 3종과 비교하여 가장 높은 빈도로 염기치환이 발생하였음을 확인 할 수 있었다( Table 5 ). 따라서 반하 6개, 대반하 1개, 호장남성 1개, 수반하 12개 위치해서 총 20개의 염기서열 위치가 각각의 종을 구별 가능한 marker nucleotide로 확인되어 한약재 半夏의 진위 감별을 위한 유전자 마커로 활용 가능 할 것으로 판단된다( Table 5 ).
Summary of Species Specific Marker Nucleotides Based on therbcL Gene.
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Summary of Species Specific Marker Nucleotides Based on the rbcL Gene.
- 3. 계통학적 분석
반하류 4종 19개채의 mat K 유전자 염기 서열 정보를 이용하여 phylogenetic tree를 작성한 결과, 속이 다른 수반하가 하나의 독립된 분계조를 형성하였고 나머지 3분류군이 하나의 다른 분계조를 형성하였다. 3분류군은 다시 반하와 호장남성이 하나의 분계조를 이루고 대반하가 독립된 분계조를 형성하는 tree를 얻을 수 있었다 ( Fig. 1 -A). rbc L 유전자 염기서열에서도 수반하가 독립된 하나의 분계조를 이루는 것은 mat K와 같았지만 하위 그룹에서 대반하와 호장남성이 하나의 분계조를 형성하였고 반하가 독립된 분계조를 형성하는 것으로 나타나 mat K 유전자와 차이를 보였다( Fig. 1 -B).
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Phylogenetic tree of P. ternata, P. tripartita, P. pedatisecta and T. flagelliforme using the UPGMA method. (A) Constructed on the basis of partial matK gene sequence, (B) Constructed on the basis of partial rbcL gene sequence.
고 찰
반하 P. ternata 는 양쯔강(陽子江, Yangtze River) 하류에서 기원하였으며 기원지를 중심으로 2배체가 많이 분포하고 양쯔강 남부지역에 6배체, 7배체, 양쯔강 북부지역에 8배체가 분포하며 일본에는 9배체의 Pinellia 종이 분포하는 것으로 보고되었다 13) . 호장남성과 대반하는 2n = 26 (n = 13) 2배체의 배수성을 띄는 반면 반하는 2n = 6 x = 78, 2n = 7 x = 91, 2n = 8 x = 104, 2n = 9 x = 117 (n = 13)로 지역에 따른 배수성에서 크게 차이를 보이는 것으로 보고되었다. 이러한 배수성의 차이는 생태적, 지역적 고립에 따른 종분화로 해석되며 배수성이 고등식물에서의 진화에 영향을 끼치는 중요한 세포유전의 과정임을 고려하면 반하 P. ternata 의 배수성에 따른 지역적 유전 특성 연구가 이루어 져야할 것이다. 이러한 지역에 따른 유전 변이 분석에 mat K, rbc L 두유전자의 유전정보를 이용한 분자 생물학적 계통분류기법이 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다 14 - 18) .
mat K 유전자 부위 염기서열은 반하, 대반하, 호장남성에서 1,286 bp, 수반하에서 1,292 bp 크기로 나타났다. 4종의 반하류에서 종간 변이와 종내 지역간 변이를 포함하여 총 55개의 염기 치환이 확인되었고, 6개의 염기 삽입이 수반하에서 관찰 되었다. 1,517 bp 크기의 rbc L 유전자 부위에서 총 35개의 염기가 치환된 것을 확인할 수 있었다. 이 중 mat K 유전자 부위 40개의 염기 위치에서, rbc L 유전자 부위 20개의 염기 위치에서 4종을 감별 할 수 있는 marker nucleotide를 확인 할 수 있었다. 4종을 구별하는 marker nucleotide 위치뿐만 아니라 종내 지역에 따른 염기서열 변이도 확인되었다. mat K 유전자에서 반하 1개, 대반하 2개, 호장남성 4개, 수반하 7개의 빈도로 염기치환이 나타났고, rbc L 유전자에서 반하 1개, 대반하 7개, 수반하 7개의 빈도로 종내 지역간 변이가 나타났으며 호장남성에서는 발견되지 않았다(data not shown). 그러나 수집된 시료의 염기서열 변이만으로 종내 지역간 특성을 구분하기에는 어려움이 있어 보다 다양한 시료에 대한 연구가 이루어져야 할 것이다.
DNA 구조 및 물리적 특징을 결정하여 비율이 높을수록 안정된 2차 구조를 형성하는 G+C(%) 염기조성 비율은 mat K 유전자에서 평균 31.6%로 평균 42.6%인 rbc L 유전자 보다 상대적으로 낮게 나타났다. mat K 유전자에서 종 간 변이 및 종내 변이정도가 상대적으로 빈번하게 관찰되었고 반하류를 감별할 수 있는 유용한 종 특이 염기서열을 많이 포함하고 있었다. 그러나 rbc L 유전자는 종간 유전적 변이가 적게 관찰되어 종을 감별할 수 있는 유용성이 mat K 유전자에 비하여 상대적으로 낮았으며 계통학적 분석에서도 mat K 유전자와 독립된 분계조를 형성하는 양상에서 차이를 보였다. 이는 rbc L 유전자 변이의 속도가 느려 종 단위 이하의 계통유연관계 분석에 적합하지 못하다는 Olmstead 와 Reeves의 결과와 일치하는 것으로 해석된다 19 , 20) . 이상의 결과를 종합하면 mat K 유전자 부위가 rbc L 유전자 부위 보다 반하류의 종 감별에 DNA 바코드로써 더 유용하게 이용될 수 있을 것으로 생각 된다.
본 연구를 통하여 mat K, rbc L 두 유전자의 유전정보를 이용한 종간 변이에 따른 marker nucleotide를 발굴하였고, 이는 반하류 4종을 신속하고 명확하게 감별 할 수 있는 분자 marker로 이용되어 한약재 半夏의 혼‧오용을 막을 수 있을 것으로 기대된다. 뿐만 아니라 이러한 유전적 특성 연구를 바탕으로 반하 식물자원의 기원을 확립하고 유용 유전자원을 확보하여 생산성이 우수하고 유용성분을 다량 함유하는 반하 품종을 육성하여 고소득 약용작물로써 반하 재배를 위한 기초자료로 활용 가능 할 것으로 기대된다.
결 론
본 연구는 한약재 半夏와 그 위품으로 유통되고 있는 호장남성과 수반하, 그리고 위품으로 유통될 가능성이 있는 대반하를 명확하게 감별하기 위한 효과적인 방법을 고안하기 위하여 DNA 바코드 부위인 mat K, rbc L 유전자 염기서열 분석을 통한 marker nucleotide를 탐색하였고 그 결과는 다음과 같다.
  • 1.matK 유전자 부위 염기서열은 반하, 대반하, 호장남성에서 1,286 bp, 수반하에서 1,292 bp 크기로 나타났으며rbcL 유전자 부위 염기서열은 4종에서 모두 1,517 bp 크기로 나타났다.matK 유전자 부위는 39개 위치에서의 치환과 1개 위치에서의 염기 삽입이 관찰되어 40개 위치에서 marker nucleotide가 확인 되었고,rbcL 유전자 부위는 20개 위치에서 염기 치환이 관찰되어 총 60개 위치에서 marker nucleotide를 이용하여 4종 모두를 판별하는 것이 가능하였다.
  • 2.matK와rbcL두 유전자 부위를 비교한 결과,matK 유전자 부위에서rbcL 유전자 부위 보다 반하류의 종 감별에 유용한 marker nucleotide를 다수 포함하고 있어matK 유전자가rbcL 유전자 보다 반하류의 종 감별에 더 유용한 DNA 바코드로 이용될 수 있을 것으로 생각 된다.
Acknowledgements
본 연구는 한국한의학연구원 ‘한의본초활용기반구축사업(K12020)'의 지원에 의해 수행되었으며, 기원식물 분류‧동정에 도움을 주신 분류‧동정 자문위원님들께 감사드립니다.
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