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Effect of Fermented Epimedii Herba Extract on the Immuno modulating Activity
Effect of Fermented Epimedii Herba Extract on the Immuno modulating Activity
The Korea Journal of Herbology. 2013. Nov, 28(6): 111-117
Copyright © 2013, The Korea Association Of Herbology
  • Received : October 13, 2013
  • Accepted : November 27, 2013
  • Published : November 30, 2013
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About the Authors
형민 정
ktmd7596@naver.com
효상 한
영종 이
garak@gachon.ac.kr

Abstract
Objectives :
This research aimed at studying the immuno modulating activity of Fermented Epimedii Herba (EHS).
Methods :
The impacts on the cell viability, hydrogen peroxide and nitric oxide (NO) generation in cells, and cytokines such as tumor necrosis factor-alpha (TNF- α ), interleukin (IL)-6, IL-1 β , monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) level have been measured by using Raw 264.7 cells with the specimen EHS as the fermented extract of Epimedii Herba with Saccharomyces cerevisiae STV89.
Results :
As a result of MTT assay to confirm the cytotoxicity of extracts from fermented Epimedii Herba, the toxicity was not excessively induced in Raw 264.7 cells when EHS were processed by concentration. EHS increased hydrogen peroxide generation in Raw 264.7 cells. EHS suppressed NO generation in Raw 264.7 cells while they significantly suppressed the increase of NO generation induced by LPS in macrophage. EHS significantly decreased the generation amount of TNF- α and IL-6 induced by LPS in Raw 264.7 cells at 25 ㎍/mL or more.
Conclusions :
It appeared that the fermented extract of Epimedii Herba manufactured from Epimedii Herba significantly has the immuno modulating acitivity as it did not excessively trigger cytotoxicity to Raw 264.7 cells, increased hydrogen peroxide generation in Raw 264.7 cells, decreased NO generation in macrophage, and especially, suppressed both TNF- α and IL-6 generation in macrophage induced by LPS.
Keywords
서 론
淫羊藿은 神農本草經 1) 中品에 “淫羊藿, 味辛寒. 主陰痿絶傷, 莖中痛, 利小便, 益氣力, 强志. 一名剛前. 生山谷.”이라고 처음 收載되었으며, 임상에서 陽痿遺精, 虛冷不育, 尿頻失禁, 腎虛喘咳, 腰膝酸軟, 風濕痹痛, 半身不遂, 四肢不仁 등을 치료하는 약물로 사용되고 있다 2) .
淫羊藿의 기원으로 대한약전 3) 에 “삼지구엽초 Epimedium koreanum Nakai, 음양곽(淫羊藿) E. brevicornum Maximowicz, 유모음양곽(柔毛淫羊藿) E. pubescens Maximowicz, 무산음양곽(巫山淫羊藿) E. wushanense T. S. Ying 또는 전엽음양곽(箭葉淫羊藿) E. sagittatum Maximowicz(매자나무과 Berberidaceae)의 지상부”라고 수재되어 있다.
淫羊藿의 성분으로 잎과 줄기에 다량의 flavonoids 화합물을 함유하고 있는데, 주로 icariin, des-o-methylicariine, β -anhydroicaritine 등이다. E. brevicornum 에는 icariin, icarisid Ⅰ이 있고, E. koreanum 에는 icariin, epimedin A, B, C, quercetin, epimedokoreanoside Ⅰ, Ⅱ, campesterol, β -sitosterol, ikarisoside A가 있다 4) . 약리작용으로는 면역증강작용 5) , 항노화작용 6) , 항산화작용 7) , 항고혈압작용 8) , 간독성 억제 작용 9) , 혈관확장작용 10) , 멜라닌 생성작용 11) 등이 보고되었다.
발효한약은 전통발효공법을 통해 전통 한약재를 미생물이 잘 이용할 수 있게 찌거나 삶은 다음, 공기 중의 미생물 또는 혹은 유산균과 같은 순수 분리 미생물을 이용하여 발효한 한약재를 말한다. 현재 다양한 제법과 형태의 발효 한약이 개발되고 있으며 특히 발효 홍삼제품과 발효 한방 화장품 등을 그 대표적 제품으로 꼽을 수 있다 12) .
발효 한약에 대한 선행 연구 논문으로 유산균으로 발효된 한국산 겨우살이 추출물의 항종양 활성 및 면역 자극 효과 13) , 버섯균사체로 발효시킨 茯苓과 厚朴의 항산화 및 항암효과 14) , 茵蔯蒿, 金銀花, 枳椇子 등의 한방소재를 주원료로 제조된 발효한약추출물로 숙취해소 효능 12) , 차가버섯과 어성초 함유 발효 조성물로 암예방 및 항암식·의약품의 소재 개발 가능성 15) 을 제시하였다. 이러한 최근의 발효연구동향에 주목하여 약리작용과 한의학에서 補腎壯陽, 强筋健骨, 祛風除濕의 효능이 있는 淫羊藿 발효 추출물의 면역 활성에 대한 연구를 하게 되었다.
이에 著者는 본 연구에서 淫羊藿을 Saccharomyces cerevisiae STV89로 발효 추출하여 제조한 시료 EHS를 대상으로 마우스 대식세포에서 세포증식율, 세포내 과산화수소(H 2 O 2 )생성과 lipopolysaccharide(LPS)에 의해 촉발되는 산화질소(nitric oxide; NO) 생성 및 각종 사이토카인(TNF- α , IL-6, IL-1 β , MCP-1) 생성에 미치는 영향을 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
재료 및 방법
- 1. 재료
- 1) 약재
실험에 사용된 淫羊藿(Epimedii Herba, Epimedium koreanum Nakai)은 한국 서울의 경동시장에서 2007년 10월에 구입하였으며, 약재의 진위와 품질의 우열을 가천대학교 한의과대학 본초학교실에서 감정하였고(No. 2007-1012) 모든 약재는 쓰기 전에 초음파 세척기(Branson, USA)를 이용하여 불순물을 제거하고 실험에 사용하였다. 淫羊藿의 발효에 사용한 균주로는 효모 균주 중 Saccharomyces cerevisiae STV89를 사용하였다.
- 2) Cell line
실험에 사용된 대식세포는 마우스 복강 대식세포(mouse macrophage line)인 Raw 264.7 세포로서 한국세포주은행(KCLB, Korea)으로부터 구입하여 사용하였다.
- 3) 시약 및 기기
본 실험을 위해서 ethyl alcohol (Samchun Chemical, Korea), DMSO (Sigma, USA), DMEM (Sigma, USA), 1×PBS (Sigma, USA), EDTA (Sigma, USA), isopropanol (Sigma, USA), trypsin-EDTA (Sigma, USA), Bio-Plex cytokine assay kit (Panomics, USA) 등이 사용 되었다. 본 실험에 사용된 기기는 CO2 incubator (Nuaire, USA), rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan), research microscope (Becton dickinson, USA), centrifuge (Hanil, Korea), fume hood (Hanil, Korea), clean bench (Jeio thec, Korea), ultrasonic cleaner (Branson, USA), microplate reader (Bio-Rad, USA), vortex mixer (Vision Scientific Co, Korea), water bath (Intron Biotech, Korea), ice-maker (Vision Scientific Co, Korea) 등이다.
- 2. 방법
- 1) 시료의 제조
淫羊藿 50 g을 정확하게 중량을 측정한 뒤 환류추출기에 1차 증류수 2,000 mL와 함께 넣은 뒤 탕액이 끓는 시점으로 부터 2시간 동안 가열하여 추출한 다음 추출액을 filter paper (Advantec No.2, Japan)로 감압 여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축액을 얻었다. 이 농축액을 동결건조기를 이용하여 건조한 분말을 시료로 사용하였다. 동결건조 추출물은 8 g을 얻었으며, 수율은 16%였다.
위에서 제조된 淫羊藿 추출물을 이용하여 다음과 같은 방법으로 淫羊藿 발효 추출물을 제조하였다.
  • ① 조효소 조제 : 조효소제인α-Herbzyme (한국효소) 3g에 증류수 100 mL를 가하고 37℃에서 30분간 침출하여 여과시킨 후 그 여액을 조효소액으로 사용하였다.
  • ② 열수출하여 건조한 淫羊藿추출물(3.0 g, pH:4.72)을 Screw cap tube에 담고 미리 추출된 조효소액 2.2mL를 첨가하여 37℃에서 2시간 효소반응하였다.
  • ③ 효소반응 후 95℃에서 10분간 살균하였다.
  • ④ Saccharomyces cerevisiae STV89를 淫羊藿추출물에 4 %씩 접종하여 30℃에서 4일간 배양하였다.
  • ⑤ 배양 후 60℃에서 20분간 열처리하였다.
  • ⑥ Saccharomyces cerevisiae STV89에서 배양 후 pH는 4.75였다.
  • ⑦ 발효가 끝난 후, 동결건조하여 시료로 사용하였으며, 세포에 처리시에는 PBS에 녹여서 사용하였다.
- 2) 세포 배양
Raw 264.7 세포는 37℃, 5% CO 2 조건에서 10% FBS, penicillin(100 U/mL), streptomycin(100 ㎍/mL)이 첨가된 DMEM 배지로 배양되었다. Raw 264.7 세포를 75 cm2 flask (Falcon, USA)에서 충분히 증식된 후 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 씻어준 후 50 mL flask 당 1 mL의 0.25% trypsin-EDTA용액을 넣고 실온에서 1분간 처리한 다음 trypsin용액을 버리고 37℃에서 5분간 보관하여 세포를 탈착하여 계대 배양하였다. 탈착된 세포는 10% FBS가 첨가된 DMEM 배양액 10 mL에 부유시킨 다음 새로운 배양용기(50mL culture flask)에 옮겨 1 : 2의 split ratio로 CO 2 배양기(37℃, 5% CO 2 )에서 배양하였다.
- 3) 세포증식율 검사
준비된 시료가 Raw 264.7 세포의 증식율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 96 well plate에 1×10 4 cells/well의 세포를 100㎕씩 넣고 37℃, 5% CO 2 incubator에서 24시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline(1×PBS) 용액으로 씻어주었다. 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료를 각 well에 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 PBS에 녹인 1 ㎎/mL MTT (Sigma, USA)를 100㎕씩 각 well에 처리하여 알루미늄호일로 차광시킨 후 2시간 동안 같은 조건에서 배양하였다. 배양액을 모두 제거한 후 DMSO를 100㎕ 처리하고 37℃에서 2시간 방치 후 microplate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Cell Proliferation은 다음 공식으로 계산되었다.
  • Cell Proliferation(%) = 100 × AT / AC
  • AC : absorbance of control
  • AT : absorbance of tested extract solution.
- 4) 과산화수소(Hydrogen peroxide) 생성 측정
세포내의 과산화수소(hydrogen peroxide, H 2 O 2 )의 생성양은 dihydrorhodamine 123(DHR) assay를 이용하여 측정하였다. 먼저, 96 well plate 1×10 4 cells/well의 cell을 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5 % CO 2 Incubator에서 24시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline(1×PBS) 용액으로 씻어주었다. 시료를 처리하기 전에 우선 DHR(10 uM)이 담긴 배지를 30 분간 각 well에 처리한 뒤 배지를 제거하였다. 다양한 농도의 시료를 배지에 담아 각 well에 처리하고 24시간동안 37℃, 5 % CO 2 Incubator에서 배양한 후 microplate reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포내 H 2 O 2 생성은 다음 공식으로 계산하였다.
  • Intracellular Productions of H2O2(%) = 100 × AT / AC
  • AC : absorbance of control
  • AT : absorbance of tested extract solution.
- 5) 산화질소(Nitric oxide) 생성 측정
산화질소(nitric oxide, NO)의 기질인 L-알기닌은 L-시트룰린과 일산화질소로 변하는데, 이는 빠르게 안정된 이산화질소, 아질산염, 질산염으로 변한다. 그리스 시약(griess reagent : 0.5 % sulfanilamide, 2.5 % phaphate, 0.5 % naphthylethylenediamine dihydrochloride, NED)은 아질산염과 화학 반응하여 보라색의 아조염을 형성하고 이것은 일산화질소의 농도와 일치하기 때문에, 아조염의 농도로부터 아질산염의 농도를 추정하기 위해 Microplate Reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO의 생성정도를 비교하였다. 이를 위해 다음과 같이 실험하였다. LPS를 단독처리(2 ㎍/mL)하거나 혹은 다양한 농도의 시료와 함께 배지에 담아 각 well에 처리하고 37℃, 5 % CO 2 Incubator에서 배양한 후 세포배양 상등액 60 ㎕을 채취하여 여기에 그리스 시약 60 ㎕을 혼합하여 15분 동안 반응시킨 후 Microplate Reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 nitric oxide 생성은 다음 공식으로 계산하였다.
  • Productions of Nitric oxide(%) = 100 × AT / AC
  • AC : absorbance of control
  • AT : absorbance of tested extract solution.
- 6) 사이토카인(cytokine) 분비 측정
사이토카인 분비와 관련된 시료의 영향을 알아보기 위해 Anderson 등 16) 의 방법을 응용하여 Bio-Plex Cytokine Assay를 다음과 같이 시행하였다. 96 well plate에 1×10 5 cells/mL의 cell을 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5 % CO 2 Incubator에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 1×PBS 용액으로 씻어준 뒤 각 well에 LPS를 단독처리(2 ㎍/mL)하거나 혹은 다양한 농도의 시료와 함께 배지에 담아 처리하고 배양하였다. 배양이 끝나면 상등액을 채취하여 Bio-Plex Suspension Array System의 Bio-Plex Cytokine Assay를 실시하여 각종의 사이토카인류(TNF- α , IL-6, IL-1 β , MCP-1)의 발현에 대한 시료의 영향을 계산, 비교하였다.
- 3. 통계처리
본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 mean ± SD로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균의 차이는 Student's t -test와 ANOVA test로 분석하여 p -value값이 0.05 미만 일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
결 과
- 1. EHS가 대식 세포에 미치는 영향
- 1) 세포증식율에 대한 효과
EHS가 대식 세포의 증식에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간 배양처리 한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 세포증식율이 증가하였다( Fig. 1 ).
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Effect of EHS on cell proliferation in Raw 264.7 cells. Cells were incubated for 24 hrs. Values are the mean ± SD of three independent experiments. EHS : Water extract of Epimedii Herba Fermented by Saccharomyces cerevisiae STV89. Normal : Treated with media only. * represents P < 0.05 compared to the normal.
- 2) 과산화수소 생성에 대한 효과
EHS가 대식세포의 과산화수소(hydrogen peroxide, H 2 O 2 ) 생성에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간의 배양결과, 50 ㎍/mL 이상의 농도에서 유의한 증가를 나타내었다( Fig. 2 ).
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Effect of EHS on the intracellular production of hydrogen peroxide in Raw 264.7 cells. Cells were incubated for 24 hrs. Values are the mean ± SD of three independent experiments. EHS : Water extract of Epimedii Herba Fermented by Saccharomyces cerevisiae STV89. Normal :Treated with media only. * represents P < 0.05 compared to the normal.
- 3) 산화질소의 생성에 대한 효과
EHS가 정상 대식세포의 산화질소(NO) 생성에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간의 배양 결과, 25 ㎍/mL이상의 농도에서 유의한 감소를 나타내었다( Fig. 3 ).
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Effect of EHS on the nitric oxide production in Raw 264.7 cells. Cells were incubated for 24 hrs. Values are the mean ± SD of three independent experiments. EHS : Water extract of Epimedii Herba Fermented by Saccharomyces cerevisiae STV89. Normal : Treated with media only. * represents P < 0.05 compared to the normal.
- 4) LPS로 활성화된 대식세포의 산화질소 생성증가에 대한 효과
EHS가 LPS로 활성화된 대식세포로부터 NO의 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다. 그 결과, 24 시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 정상군(Normal) 보다 NO 생성이 유의하게 증가하였으며 LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 EHS는 25, 50, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의하게 감소되었다. 48 시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우에도 정상군(Normal) 보다 NO 생성이 유의하게 증가하였으며 LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 EHS는 50, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의하게 감소되었다( Fig. 4 ).
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Effect of EHS on the nitric oxide production in Raw 264.7 cells treated with lipopolysaccharide (LPS; 2 ㎍/mL). Cells were incubated for 24 and 48 hrs. Values are the mean ± SD of three independent experiments. EHS : Water extract of Epimedii Herba Fermented by Saccharomyces cerevisiae STV89. Normal : Treated with media only. Control : Treated with LPS only. # represents P < 0.05 compared to the normal. * represents P < 0.05 compared to the control.
- 5) 면역사이토카인 생성에 대한 효과
- (1) TNF-α 생성에 대한 효과
EHS가 LPS로 활성화된 대식세포에서 TNF- α 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다. 그 결과, 3시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 정상군(Normal)보다 유의하게 TNF- α 생성이 증가하였으며, LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 25, 50, 100 ㎍/mL의 농도에서 모두 유의하게 감소되었다( Fig. 5 ).
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Effect of EHS on the IL-6 production in Raw 264.7 cells treated with lipopolysaccharide (2 ㎍/mL). Cells were incubated for 3 hr. Values are the mean ± SD of three independent experiments. EHS : Water extract of Epimedii Herba Fermented by Saccharomyces cerevisiae STV89. Normal : Treated with media only. Control : Treated with LPS only. # represents P < 0.05 compared to the normal. * represents P < 0.05 compared to the control.
- (2) IL-6 생성에 대한 효과
EHS가 LPS로 활성화된 대식세포에서 IL-6 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다. 그 결과, 3시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 정상군(Normal)보다 유의하게 IL-6 생성이 증가하였으며, LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 모두 유의하게 감소되었다( Fig. 6 ).
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Effect of EHS on the IL-6 production in Raw 264.7 cells treated with lipopolysaccharide (2 ㎍/mL). Cells were incubated for 3 hr. Values are the mean ± SD of three independent experiments. EHS : Water extract of Epimedii Herba Fermented by Saccharomyces cerevisiae STV89. Normal : Treated with media only. Control : Treated with LPS only. # represents P < 0.05 compared to the normal. * represents P < 0.05 compared to the control.
- (3) IL-1β 생성에 대한 효과
EHS가 LPS로 활성화된 대식세포에서 IL-1 β 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다. 그 결과, 24시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 정상군(Normal)보다 유의하게 IL-1 β 생성이 증가하였으며, LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 25 ㎍/mL 일 때 만 유의하게 감소되었다.
- (4) MCP-1 생성에 대한 효과
EHS가 LPS로 활성화된 대식세포에서 monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다. 그 결과, 24시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 정상군(Normal)보다 유의하게 MCP-1 생성이 증가하였으며, LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 25 ㎍/mL 일 때 만 유의하게 감소되었다.
고 찰
淫羊藿은 神農本草經 1) 中品에 처음 收載되었으며, 名醫別錄 17) 에 “治喉痺, 多服令人溏洩”이라고 한이래 味辛, 甘, 性溫하고, 補腎壯陽, 强筋健骨, 祛風除濕의 효능이 있다 2) .
淫羊藿의 기원으로 대한약전 3) 과 중국약전 18) 에 “삼지구엽초 Epimedium koreanum Nakai, 음양곽(淫羊藿) E. brevicornum Maximowicz, 유모음양곽(柔毛淫羊藿) E. pubescens Maximowicz, 무산음양곽(巫山淫羊藿) E. wushanense T. S. Ying 또는 전엽음양곽(箭葉淫羊藿) E. sagittatum Maximowicz(매자나무과 Berberidaceae)의 지상부”라고 수재되어 있다. 그러나 북한약전 19) E. koreanum 1종을 기원식물로, 대만약전 20) E. brevicornum 및 동속근연식물로, 일본약전 21) 대한약전에 수록되어 있는 기원종과 함께 E. grandiflorum Morren var. thunbergianum Nakai 및 E. sempervirens Nakai를 포함하고 있다.
산지는 우리나라에서는 강원, 경기, 평남북, 함남북에 분포하며, 중국에서는 그 기원 식물에 따라 다양한 지역에서 산출되는데, E. brevicornum Maximowicz은 주로 陝西, 山西, 安徽, 江西 등지에서, E. sagittatum Maximowicz은 주로 湖北, 四川, 浙江, 湖南, 陝西, 江西 등지에서, E. koreanum Nakai는 遼寧, 吉林 등지에서, 柔毛淫羊藿은 주로 四川에서 생산된다 22) .
淫羊藿의 성분으로 최근 flavonol glycoside인 korepimedoside A 및 B가 국산 음양곽에서 분리되어 있다. 채취시기에 따른 함량 변화의 연구에 의하면 개화기인 5월에 채취한 경우 flavonoid 함량이 가장 많다고 알려져 있다 23) .
발효(fermentation)는 넓은 의미에서 미생물을 이용하여 그 효소작용으로 유기물을 전환시키는 것을 뜻한다 24) . 최근 한약제형의 다양화를 위한 시도 중에 한약 혹은 한약재를 발효하여 한약의 안전성을 확보면서 효능의 증대를 시도하거나 새로운 약효를 발굴하는 등의 다양한 연구들이 보고되고 있으며, 쑥을 발효하는 방법 개발이나 발효쑥의 효용성 증대에 대한 보고 또한 많이 이루어지고 있다 25) .
이에 著者는 발효한약의 유의성을 적용하여 淫羊藿을 발효추출하여 만들어진 시료 EHS로 마우스 대식세포를 이용한 세포증식율, 세포내 과산화수소 및 산화질소 생성, 그리고 사이토카인(TNF- α , IL-6, IL-1 β , MCP-1) 생성에 미치는 영향을 측정하였다.
발효미생물 Sacchromyces계통은 생화학적 성질이 일정하고, 물에 잘 분산되며, 자기소화에 대한 내성이 있어서 보존성이 좋고, 당밀배지에서 증식속도가 빠르고 수득률이 높은 성질이 있다 26) . 이에 본 실험에서는 Saccharomyces cerevisiae STV89(효모)를 균주로 이용하여 발효하였다.
본 연구에서는 마우스 대식세포인 Raw 264.7에 발효 淫羊藿 추출물을 25, 50, 100, 200 ㎍/mL의 농도로 처리하여 세포증식율에 대한 영향을 검사한 결과, 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 발효 淫羊藿 추출물이 세포증식율 감소를 나타내지 않았으며 이는 발효 淫羊藿 추출물이 세포독성을 유발하지 않는다는 것으로 볼 수 있다. 또한 50 ㎍/mL 이상의 농도에서는 세포증식율을 유의하게 증가시키는 것이 확인되었는데, 이는 본 추출물이 대식세포의 수를 늘림으로써 면역기능을 강화하는 것으로 해석될 수 있을 것이다. 이와 같은 결과를 바탕으로 다음 단계의 실험에서는 200 혹은 100 ㎍/mL의 농도까지 사용하였다.
과산화수소(Hydroperoxide, H 2 O 2 )는 대부분의 세포 내에서 발생하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 일종으로 산화 스트레스(oxidative stress)와 관련되며, 대식세포와 같은 면역세포에 있어서는 감염체를 공격하거나 노후화된 세포를 제거함에 이용된다 27) . DHR은 비형광이지만 세포 내에서 세포 내 H 2 O 2 에 의하여 산화되어 녹색의 형광을 발현하는 물질인 rhodamine 123(R123)로 바뀌게 된다. 그러므로 여러 가지 산화적 반응을 일으키는 물질들로 인해 mouse의 대식세포 내에서 발생하는 reactive oxygen species(ROS)의 수준을 dihydrorhodamine 123(DHR)assay을 이용하여 측정할 수 있다. 본 연구결과 EHS는 50 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 대식세포로부터의 과산화수소 생성을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다. 비록 EHS에 의한 세포증식율 증가에는 미치지 못하지만, 유의한 증가가 나타났다는 것은 EHS가 대식세포의 항병(抗病)능력을 감퇴시키지 않음을 의미하는 것이다.
질소 중간산대사물 중 하나인 산화 질소(nitric oxide, NO)는 면역전달물질인 사이토카인의 영향으로 면역세포로부터 생산되어, 염증반응부위에 유리됨으로서 Fe-S를 함유하는 효소의 작용을 억제 시키거나 DNA에 소산을 미쳐 항미생물, 항균 작용이나 항암 작용을 나타낸다. 28) 그러나 감염 등으로 유발되는 인체의 염증반응에 있어서 NO의 과잉생성은 급만성의 염증질환 발생·악화와 연관되어진다고 할 수 있다. 본 연구에서 EHS는 24시간에서 25 ㎍/mL이상의 모든 농도에서 대식세포로부터 NO의 생성을 감소시켰으며, 또한 LPS로 활성화된 대식세포에서는 24시간의 배양에서 25, 50, 100 ㎍/mL 일 때, 48시간의 배양에서는 50, 100 ㎍/mL의 농도에서 NO 생성증가를 유의하게 억제시키는 것으로 나타났다. 이는 EHS가 활성화된 대식세포로부터 분비되는 NO의 증가를 효과적으로 억제함으로써 NO 증가로 악화될 수 있는 급성 혹은 만성의 염증반응을 제어할 수 있는 효능을 가지고 있음을 의미한다.
TNF- α 는 다양한 면역학적 기능을 가진 사이토카인으로, 염증 반응의 초기에 생산되어 IFN-v, IL-6, IL-8, IL-10 등과 같은 사이토카인과 여러 세포부착물질의 생산을 유발한다. 29 , 30) EHS가 LPS로 활성화된 대식세포에서 TNF- α 생성증가에 미치는 영향을 비교했을 때 3 시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 정상군(Normal)보다 유의하게 TNF- α 생성이 증가하였으며 LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 25 ㎍/mL이상의 모든 농도에서 모두 유의하게 감소되었다.
IL-6는 면역 세포와 지방 조직에서 생성되는 사이토카인으로서, 간에서 생산되는 급성기반응물질(acute phase reactant)의 강력한 유발인자이며 당대사와 지질 대사에 관여한다. 31 , 32) EHS가 LPS로 활성화된 대식세포에서 IL-6 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였는데 3 시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 정상군(Normal)보다 유의하게 IL-6 생성이 증가하였으며 LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 모두 유의하게 감소되었다.
이 밖에 LPS에 의한 24 시간의 배양으로 유발된 IL-1 β 와 MCP-1의 면역사이토카인 생성 증가에 대해서는 EHS가 별다른 유의성을 나타내지 않았다.
본 연구를 통해 발효 淫羊藿(EHS)의 염증억제작용에 대한 효과는 확인한 결과 LPS에 의해 활성화된 대식세포에서의 NO, TNF- α 그리고 IL-6의 생성 증가가 억제됨을 확인하였으며, 이는 EHS가 면역조절 사이토카인의 발현을 조절함으로써 염증 반응 조절 효능이 있음을 의미하는 것이다.
이상의 결과, 발효 淫羊藿 추출물은 대식세포에 세포증식율 감소를 유발하지 않는 농도에서 과산화수소의 생성을 증가시키고 산화질소의 생성을 감소시켰으며 LPS로 활성화된 대식세포에서 산화질소와 TNF- α , IL-6의 면역사이토카인 생성 증가를 억제시킴으로써 유의한 면역조절 활성이 있음을 알 수 있었다. 앞으로 발효 淫羊藿 추출물을 이용한 대식세포 연관 면역질환 치료제로의 개발을 위하여 더욱 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
결 론
Saccharomyces cerevisiae STV89 효모로 발효 추출한 淫羊藿의 마우스 대식세포인 Raw 274.7 세포에서의 염증유발물질 생성에 미치는 영향을 측정하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
  • 1. 淫羊藿 발효 추출물은 대식세포에서 세포증식율 감소를 유발하지 않았다.
  • 2. 淫羊藿 발효 추출물은 정상 대식세포의 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2) 생성을 유의하게 증가시켰다.
  • 3. 淫羊藿 발효 추출물은 정상 대식세포의 산화 질소(nitric oxide, NO)의 생성을 억제시켰으며, 또한 LPS로 활성화 된 대식세포의 NO 생성 증가를 유의하게 감소시켰다.
  • 4. 淫羊藿 발효 추출물은 LPS로 활성화된 대식세포에서 TNF-α와 IL-6 생성을 모두 유의하게 감소시켰다.
이상의 결과, 발효 淫羊藿 추출물은 대식세포에 세포증식율 감소를 유발하지 않는 농도에서 과산화수소 생성 증가 및 활성화된 대식세포로부터 산화질소의 생성과 면역조절 사이토카인의 생성을 억제함으로써 유의한 면역활성을 가지는 것으로 나타났다.
References
Wu B 1999 Shennongbencaojing. Kexuejishuwenxian publisher Beijing 63 -
1999 State Administration of Traditional chiense medicine of the People’s Republic of China. Zhonghuabencao. Shanghai Scientific and Technical Publishers Shanghai Vol. 3 308 - 15
Korea Food and Drug Administration 2012 The Korean Pharmacopoeia Tenth Edition. Korea Food and Drug Administration Seoul 88 - 9
Kim HC 2001 Hanyakyakri-Hak. Jipmoondang Seoul 445 - 7
Liang HR , Vuorela P , Vuorela H , Hiltunen R 1997 Isolation and immunomodulatory effect of flavonol glucosides fromEpimedium hunanense. Planta Med. 63 (4) 316 - 9    DOI : 10.1055/s-2006-957690
Chiba K , Yamazaki M , Umegaki E , Li MR , Xu ZW , Terada S , Taka M , Naoi N , Mohri T 2002 Neuritogenesis of herbal (+)- and (-)-syringaresinols separated by chiral HPLC in PC12h and Neuro2a cells. Biol Pharm Bull. 25 (6) 791 - 3    DOI : 10.1248/bpb.25.791
Lee JW , Do JH , Lee SK 2000 Antioxidant Activity of the Aerial Part of Epimedium koreanum NAKAI. J Korean Soc Food Sci Nutr. 29 (4) 732 - 6
Choi HI , Lee SI , Ahn DK , Kim HC 1997 A Study on the Antihypertensive Effect of Epimedii Herba. Kor J Herbology. 12 (1) 35 - 44
Lee MK , Choi YJ , Sung SH , Shin DI , Kim JW , Kim YC 1995 Antihepatotoxic activity of icariin, a major constituent of Epimedium koreanum. Planta Med. 61 (6) 523 - 6    DOI : 10.1055/s-2006-959362
Stevens JF , Taylor AW , Nickerson GB , Ivancic M , Henning J , Haunold A , Deinzer ML 2000 Prenylflavonoid variation in Humulus lupulus: distribution and taxonomic significance of xanthogalenol and 4'-O-methylxanthohumol. Phytochemistry. 53 (7) 759 - 75    DOI : 10.1016/S0031-9422(00)00005-4
Chun HJ , Mun YJ , Kim JH , Kim IK , Jeon BH , Woo WH 2000 Effect of the Aqueous Extract of Epimedium Koreanum Nakai on Melanin Formation in B16 Mouse Melanoma Cell Line. Yakhak Hoeji. 44 (5) 455 - 62
Jung YJ , Han DO , Choi BH , Park C , Lee HJ , Kim SH , Hahm DH 2007 Effect of Fermented Herbal Extracts, HP-1 on Enzyme Activities and Gene Expressions Related to Alcohol Metabolism in Ethanol-loaded Rats. Korean J Orient Physiol Pathol. 21 (2) 387 - 91
Yoon TJ , Yoo YC , Kang TB , Lee KH , Kwak JH , Baek YJ , Huh CS , Kim JB 1999 Fermented Extracts of Korean Mistletoe with Lactobacillus (FKM-110) Stimulate Macrophage and Inhibit Tumor Metastasis. Korean J Food Sci Technol. 31 (3) 838 - 47
Shon MY 2007 Antioxidant and Anticancer Activities of Poria cocos and Machilus thunbergii Fermented with Mycelial Mushrooms. Food Ind Nutr. 12 (2) 51 - 7
Cha JY , Jeon BS , Park JW , Moon JC , Cho YS 2004 Effect of Fermented Compositions Containing Inonotus obliquus with Houttuynia cordata on Growth of Human AGS Gastric and HCT-15 Colon Cancer Cells. J Kor Soc Appl Biol Chem. 47 (2) 202 - 7
Politch JA , Tucker L , Bowman FP , Anderson DJ 2007 Concentrations and significance of cytokines and other immunologic factors in semen of healthy fertile men. Hum Reprod. 22 (11) 2928 - 35    DOI : 10.1093/humrep/dem281
Tao HJ 1986 Mingyibielu. Renminweisheng publisher Beijing 143 - 4
State Pharmacopoeia Commission 2005 Chinese Pharmacopoeia 2005 edition. Chemical Industry Press Beijing 267 - 8
Pharmacopoeia Commission of the Democratic People's Republic of Korea Ministry of Health 1996 Democratic People's Republic of Korea Pharmacopoeia 5th edition. Medical Science Publishers Pyongyang 213 -
Department of Health Medicine Committee Pharmacopoeia Editorial Committee 1985 ROC medicine model 1985 edition. Tat Cheong Printing Co Ltd. New York 625 - 6
Ministry of Health, Labour and Welfare 1996 Japanese Pharmaceutical Council. Hirokawa Shoten Tokyo 1178 - 9
Kim IR , Kim HC , Kuk YB , Park SJ , Park YK , Park JH , Seo BI , Seo YB , Shin MK , Lee YJ , Lee YC , Lee JH , Leem KH , Cho SI , Chung JK , Joo YS , Choi HY 2004 Boncho-Hak. Young-Lim Press Seoul 602 - 3
Kim DH , Kim HM , Ryu JH , Eom JY , Kim SC , Yang JH , Cho MK , Lim JP , Hong SH 2007 Hanbangyakrihak. Shinilbukseu Seoul 462 - 6
Sim SK , Son HS , Sim CH , Yoon WH , Hwang JH , Bang BH 2001 Balhyosikpum-Hak. Jinro publisher Seoul 11 -
Park WS 2010 Effect of Artemisiae Argi Folium Fermented with Sacchromyces Cerevisiae on Viability of Human Hepatocyte Treated with Toxicants Korean J. Orient Physiol Pathol. 24 (2) 284 - 9
Ha DM 1994 Sinpyeon Balhyogong-Hak. Moonundang Seoul 288 -
Lee EH , Shin JW , Yoon SK , Son HJ , Lee JY , Ku SW , Kim JU , Lee YM 2009 Effects of propofol and etomidate on hydrogen peroxide-induced oxidative damage in hepatocyte. Korean J Anesthesiol. 57 (3) 331 - 6    DOI : 10.4097/kjae.2009.57.3.331
MacMicking J , Xie QW , Nathan C 1997 Nitric oxide and macrophage function. Annu Rev Immunol. 15 323 - 50    DOI : 10.1146/annurev.immunol.15.1.323
Peter Parham 2006 Myeonyeokhak. LifeScience Seoul 454 -
Schena FP , Gesualdo L. , Grandaliano G , Montinaro V 1997 Progression of renal damage in human glomerulonephritides : is there sleight of hand in winning the game?. Kidney Int. 52 (6) 1439 - 57    DOI : 10.1038/ki.1997.475
Yudkin JS , Kumari M , Humphries SE 2000 Inflammation, obesity, stress and coronary heart disease: is interleukin-6 the link?. Atherosclerosis. 148 (2) 209 - 14    DOI : 10.1016/S0021-9150(99)00463-3
Mohamed-ali V , Pinkney JH , Coppack SW 1998 Adipose tissue as an endocrine and paracrine organ. Int J Obes Relat Metab Disord. 22 (12) 1145 - 58    DOI : 10.1038/sj.ijo.0800770