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Amperometric detection of hydrogen peroxide at an azalea peroxidase embedded enzyme electrode
Amperometric detection of hydrogen peroxide at an azalea peroxidase embedded enzyme electrode
Analytical Science & Technology. 2014. Jul, 27(4): 181-186
Copyright © 2014, The Korean Society of Analytical Science
  • Received : March 03, 2014
  • Accepted : July 07, 2014
  • Published : July 01, 2014
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길 중 윤
kjyoon@cju.ac.kr
1. 서 론
과산화수소는 세포 신진대사에 의하여 생체 내에서 생성되기도 하며 산업분야에서 각종 화합물의 제조시약 및 산화제로서 다양한 용도를 갖는 물질이다. 1 과산화수소의 정량에는 고전적인 방법이나 분광학적 방법보다 효소전극을 이용하는 전기화학법이 보다 널리 이용되고 있다. 2 전기화학적 방법이 정량분석에 소요되는 비용과 시간을 최소화할 수 있는 이점이 있기 때문이다. 3 효소전극 제작 시 효소를 전극에 고정하는 방법에는 흡착법, 4 스크린 프린팅법, 5 졸-겔법, 6 전도성 고분자를 이용하는 법 7 등 다양한 방법들이 있다. 이들 중 탄소가루의 결합재로 미네랄 오일을 사용하는 탄소반죽법은 전극제작이 신속하고 용이하다는 면에서 가장 우수한 방법이라 할 수 있다. 8 그러나 이것이 효소의 특성연구에 최적의 방법이라 할 수 있을지라도 반죽이 기계적 물성을 갖지 않기 때문에 바이오센서로서 실용화 가능성은 전무하다. 9
대부분의 고무는 톨루엔에 용해되고 용매는 휘발성이 강하여 쉽게 탄소반죽으로부터 제거될 수 있다. 이점에 착안하여 본 연구실에서는 고무용액을 탄소가루의 결합재로 사용하여 반죽을 성형하였으며 용매가 휘발된 후 얻어진 전극물질의 기계적 견고성은 탄소 반죽전극 실용화의 새로운 계기가 되었다. 10
전극 제작 시 시판 추출효소를 사용하면 전극의 신호가 보다 안정적이고 증대되는 효과를 얻을 수 있다. 11 그러나 전극 제작의 고비용은 그것의 범용 및 양산에 저해요인이 된다. 최근 효소전극의 제작에 상업용 효소를 이용하는 대신 식물 또는 동물조직을 효소원으로 사용하면 저렴한 가격, 긴 수명, 높은 촉매력 등 많은 이점이 있다는 사실이 입증되었다. 12
지금까지 언급된 사항들을 종합하여 본 연구실에서는 고무용액을 결합재로 사용하고 시판 효소를 생활 주변에서 얻기 쉬운 효소원으로 대치하고자 노력하였으며 여러 종의 동식물 조직을 사용하여 활용 가능성을 시험하고 그 결과를 수차례 보고한 바 있다. 13 이 논문은 이런 노력의 일환이며 진달래 조직을 이용하여 효소전극을 제작하고 그것의 전기화학적 정량 특성을 살펴 본 내용을 포함하고 있다. 결과는 만족스러운 것이었으며 진달래 조직이 과산화수소 정량을 위한 실용 효소전극 물질로 활용될 수 있음을 보여 주었다. 이 논문은 그 내용을 보고하고 있다.
2. 실 험
- 2.1. 시약 및 기구
효소원은 호모게나이저로 완전히 파쇄된 진달래잎 조직을, 전극물질로 Fluka의 흑연가루(Anal N. 378326/1 21698, ≤0.1 mm)를, 결합재(binder)로 클로로술폰화 폴리에틸렌 고무(chlorosulphonated polyethylene rubber, CSM, Denki Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Mitsui C.)를 사용하였다. Junsei의 과산화수소(Junsei Chem. Co. Ltd., 35%)를 기질로, 매개체로 페로센(dicyclopentadienyliron, Sigma, F-3375)을, 전해질로 NaCl (Shinyo pure Chem. ≥ 95.5%)을 사용하였다. Sigma-Aldrich의 톨루엔(HPLC용, ≥ 99.9%)이 고무의 용제로 사용되었다. CV 및 LSV는 기준전극과 보조전극으로 Ag/AgCl(BAS MF 2052)과 Pt전극(BAS MW 1032)을 BAS Model EPSILON (Bioanalytical System, Inc., U.S.A.) 전압전류계에 연결하여 얻었으며, 이외의 신호 측정은 EG&G Model 362 (Princeton Applied Research)를 사용하였다.
- 2.2. 전극 제작
0.09 g의 페로센을 포함하고 있는 CHCl 3 10 mL에 0.91 g의 흑연가루를 넣어 완전히 혼합시키고 실온에서 건조하였다. 이 가루와 1.5% CSM 고무용액을 1:1 (wt/wt)로 혼합하여 반죽을 만든 후 이 반죽 1.0 g에 파쇄된 진달래 조직 0.2 g을 합하여 완전히 혼합시켰다. 오옴 접촉을 갖는 깊이 1 mm, 직경 6.67 mm의 원형 폴리에틸렌 튜브에 위 반죽을 채우고 표면을 스패튤라를 이용하여 완전평면으로 성형한 후 작업전극으로 사용하였다. 14
3. 결과 및 고찰
전기화학측정에서 순환전압전류곡선은 전극표면에서 일어나는 반응의 특성을 파악할 수 있는 화학적 초기진단법으로 널리 활용된다. 수용액 중에서 과산화수소를 검출하기 위하여 제작된 진달래 과산화효소 고정 효소전극의 전기화학적 특성을 보여주는 순환전압전류곡선이 1 에 주어져 있다. 환류상태의 0.1 M NaCl 전해질 용액 중에서 얻은 이 그림은 a, b, c, d의 네 전압-전류 곡선으로 구성되어 있고, a와 b는 기질을 가하기 전, c와 d는 기질을 가한 후 얻은 것이다. a는 전극전위가 증가함에 따라 바탕전류가 증가하는 것을 보여준다. 실험 전위영역에서 매개체인 페로센은 이미 환원된 상태이며 전해질 용액의 산화-환원전류가 여기에 포함되지 않는다는 사실은 이미 확인된 바 있다. 15 따라서 이 신호를 구성하는 가능한 전류는 이중층 충전전류, 결합재로 사용된 고무 및 효소원으로 사용된 진달래 조직이 포함하고 있는 물질의 산화-환원 전류 등이 예상된다.
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Hydrodynamic 4-segment cyclic voltammogram showing the electrochemical behavior of the azalea electrode. (a) and (b): in the absence of subsrate; (c) and (d): in the presence of 2.0 × 10−2 M H2O2. Scan rate: 25 (mV/s). Arrow indicates the time of H2O2 addition.
Reed-Horn 반응의 혼합 생성물인 결합재 CSM 고무와 16 진달래 조직의 구성 성분을 여기에서 확인할 수 없으나 이들의 산화-환원 전류가 있다면 이들의 바탕전류에 대한 기여는 충전전류와 더불어 a와 c 및 b와 d에 공통적일 것이다. 그러므로 기질 첨가 전후의 전류차를 신호로 간주하는 본 계에서 이들의 존재는 문제되지 않는다.
c를 얻을 때 -200 mV 이하에서 볼 수 있는 전류계단(화살표)은 기질 추가 시 신호가 급변하는 것을 보여주고 있다. 이 변화는 실험 조건의 변화 없이 기질추가에 기인한 것이므로 순수한 기질의 분해전류로 볼 수 있다.
기질의 확산에 의한 전극감응의 거동을 살펴보기 위하여 1 과 동일한 실험이 정지된 용액 중에서 행하여졌고, 이로부터 1 의 c와 a에 해당하는 것의 전류차를 전극전위에 따라 도시한 것이 2 이다. 전극반응이 확산에 의존할 경우 전압-전류 그림은 폴라로그래피파처럼 S자 형이다. 여기서 전체 파형을 확인할 수 없는 것은 실험 전극전위가 -0.35 V로 제한되어 있기 때문으로, 2 는 S자 형의 일부분에 해당한다. 신호전류와 전극전위 사이의 관계를 볼쯔만 방식으로 시뮬레이션한 함수식은 아래 식과 같다.
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Current difference between (c) and (a) in a static solution. Other conditions are the same as in Fig. 1.
i = -0.00017 + 0.768/[1 + exp{(E +0.506)/0.0793}]
여기서 신호전류 i(mA)는 유효면적이 0.316 cm 2 인 전극으로부터 얻은 것이며 E는 전극전위(V)이다. 위 식으로부터 음전위의 극한치(E→ -∞)에서 얻어지는 전류는 0.768 mA로 본 계(n=1)가 생성하는 한계전류(i l,c )로 간주할 수 있다. 17 이것으로부터 도출되는 진달래 전극계의 질량이동계수(mass transfer coefficient), m o 와 질량이동저항(mass transfer resistance), R mt 는 각각 1.26 × 10 −3 cm/sec와 33.5 Ω 이다.
. 2 로부터 도출한 Tafel 도시[ln i/(1-exp(nfη)) vs. η ]가 . 3 에 주어져 있다. 좋은 직선성을 보여주고 있으며 기울기 -αnf와 절편 ln i 0 은 각각 -12.6 및 -13.6이다. 생체 내에서 Fe 2+ 이온과 과산화수소의 반응은 일 전자 전이반응(n=1)으로 알려져 있다. 17 여기서 얻어지는 대칭인자(α)와 교환전류밀도(i 0 )는 각각 0.35 및 1.06 × 10 −5 A/cm 2 이다. 대칭인자는 장미전극의 0.34와 대체로 유사한 반면 교환전류밀도(i 0 )는 9.19 × 10 −7 A 와 차이가 있는데 이는 전극 물질의 건조 정도에 따른 전극저항에 의한 오차로 보여진다. 18
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Wave slope plot for the reduction of 2.0 × 10−2 M H2O2 in 0.1 M NaCl.
전극전위가 반응속도에 미치는 영향은 대칭인자가 0.5보다 큰 경우 전극전위 변화에 대하여 작은 기울기를 가지며 0.5보다 작은 경우는 그 반대이다. 식물조직 함유 효소전극의 대칭인자는 0.5보다 작은 경우가 일반적인데 여기서 진달래 전극이 0.35의 작은 값을 보여주는 것은 바이오센서의 감응속도가 전극전위 변화에 민감한 것을 말하여 준다.
. 4 는 환류상태의 전해질 용액 중에서 0.1 M H 2 O 2 용액 50 μL를 순차적으로 8회 가했을 때 기질농도가 증가함에 따라 신호전류가 증가하는 것을 보여주고 있다. 이 방법은 화학종의 질량이동이 환류에 의존하므로 질량이동 속도가 화학종의 확산속도보다 훨씬 커서 정류상태에 도달하는 시간이 최소화된다. 반응속도를 기질농도에 따른 반응속도의 변화율에 대하여 도시한 것이 Eadie 도시이며, 이것이 직선일 때 화학반응은 효소의 촉매작용에 의한 것이다. 이 도시는 기질농도가 큰 경우 작은 오차를 발생하는 장점이 있다. . 5 의 창에 농도변화에 따른 신호의 누적 합산 크기를 도시한 검정곡선이 주어져 있다. 이것으로 부터 도출된 Eadie 도시, . 5 는 좋은 직선성을 보여주고 있는데, 이것은 과산화수소의 분해가 진달래 전극에 함유된 과산화효소의 촉매작용에 의한 것임을 말하여 주고 있다. 여기서 얻은 계의 최대속도(V)와 Michalis 상수(K m )는 각각 1.05 × 10 −6 A와 7.29 × 10 −4 M 이다.
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Amperometric response for successive 50 μL additions of 0.1 M substrate solution to the 10 mL of electrolytic solution at -350 mV.
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Eadie plot of the signal current and the substrate concentration.
전극과 용액의 계면은 반대 전하를 띤 두 전기층이 마주보고 있는 컨덴서 구조이며 여기에 관하여 Bockris, Devanathan 및 Miller에 의하여 제시된 모형이 현재 널리 용인되고 있다. 그들은 전극 표면으로부터 외부 Helmholtz 층까지를 내부 조밀 전기이중층 (inner compact double layer), 그 밖의 층을 확산 전기이중층(diffuse double layer)으로 구분한다.
R s 와 C를 각각 용액의 저항 및 이중층의 커패시턴스라고 할 때 충전전류는 시간(t)에 대하여 i = E/ R S exp(-t/R s C)의 관계를 가지며 컨덴서가 충전되어 있지 않을 경우(t = 0) i = E/R s 및 τ= R s C의 관계가 성립한다. 순수 전해질 용액(0.1 M NaCl) 중에서 -350 mV의 계단전위를 인가하여 얻은 전류-시간 그림이 . 6 에 주어져 있다. 그림이 보여주듯 측정기기는 0.005 sec로 디지털화되어 있기 때문에 t = 0에서 전류를 측정하는 것은 불가능하므로 초기(t = 0)의 순간전류를 얻고자 한다면 전류의 경향성을 시뮬레이션하여 t = 0으로 외삽하는 방법을 취하여야 한다. 0.01 및 0.001 M 용액에서 동일 방법으로 얻은 시간-전류가 함께 1 에, 그리고 이들의 함수 관계식이 2 에 주어져 있다. 3 은 이것으로부터 도출된 i t=0 , R s , C, C d , C i 및 실측 시간상수 τ를 포함하고 있다. 전해질 농도가 감소함에 따라 시간상수가 증가하는 것을 볼 수 있는데 이것은 용액저항 증가에 따른 이중층 형성의 지연에 기인하는 것으로 볼 수 있다. 또 τ = R s C로 부터 계산된 축전용량은 전해질 농도가 묽어짐에 따라 증가하는 것을 보여주는데 전해질 이온의 농도 감소에 의한 용액의 유전률의 증가로 설명될 수 있다.
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Time profile of the double-layer charging current for a potential step in the electrolytic solution (0.1 M NaCl). Start potential : 0 (mV); step potential : -350 (mV).
Time-dependence of the double-layer charging current at three different electrolyte concentrations at -350 mV (vs. Ag/AgCl)
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Time-dependence of the double-layer charging current at three different electrolyte concentrations at -350 mV (vs. Ag/AgCl)
Relationships between condenser current and charging time inTable1, i (mA) = A1 × exp(-t/t1) + i0
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Relationships between condenser current and charging time in Table 1, i (mA) = A1 × exp(-t/t1) + i0
Electrode parameters of the azalea embedded biosensor
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it=0: condenser current at t=0 sec; Rs: solution resistanceτ: time constant(obs); C: effective double layer capacitanceCd: capacitance of the diffuse double layerCi: capacitance of the inner compact double layer
Gouy-Chapmann 이론에 의하면 확산 이중층(diffuse double layer)의 커패시턴스, C d 는 228sqrt(c')cosh(19.47zϕ)로 주어지는데 본 계에서 얻은 값들은 수용액에서 일반적으로 얻어지는 값(10~30 F cm −2 )보다 크다. 이 증가는 흑연가루를 둘러싸고 있는 고무 결합재의 유전상수 증가에 기인하는 것으로 볼 수 있다. 한편 C d ≫ C i 의 관계는 계의 유효 커패시턴스가 내부 조밀층의 커패시턴스, C i 에 의존함을 뜻한다.
. 1 에서 c와 d의 형태가 유사한 사실로부터 기질의 분해반응이 비가역적임을 정성적으로 예측할 수 있었다. 반응의 가역성을 정량적으로 판단하는 기준에는 여러 가지가 있으나 이중전위계단법(double potential step technology)이 간단하고 효율적이다. . 7 은 0.01 M H 2 O 2 용액으로부터 이중계단기법으로 얻은 전류-시간 그림을 보여주고 있다. 기질의 환원생성물은 물이다. 선택된 제1계단 전위 -350 mV와 제2계단 전위 0 mV(vs. Ag/AgCl)는 . 1 을 고려할 때 각각 기질의 환원과 산화가 일어날 수 있는 전위이다. 각 계단의 전류채취 시간 t f 와 t f +τ(τ = 1 sec)에서 측정된 전류, i f 와 i r 4 에 함께 주어져 있다. 그리고 실험으로부터 얻은 -i r /i f 와 완전가역일 경우의 이론치 1-(1-τ/tr) 1/2 . 8 에 함께 도시되어 있다. 계가 이상적인 완전가역계라면 -i r /i f 은 1-(1-τ/t r ) 1/2 과 일치해야 하나 이들은 현격한 차이를 보여주고 있다. 우선 t f =0.001 sec에서 -i r /i f 은 0.14이며 0.002~0.008 sec의 전 구간에서 0.14보다 작은 값을 보여주고 있다. 전압이 역전될 때 신호전류에 잔류전류와 충전전류가 포함되어 있으므로 이것을 고려하면 실험전위 영역에서 물의 산화반응은 없는 것으로 볼 수 있다. 따라서 본 계에서 기질분해의 역반응은 비가역적이라고 할 수 있다.
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Current transient resulting from the double step technique. Start potential: 0 (mV); first step E : -350 (mV); second step E: 0 (mV). [NaCl]: 0.002 M.
4.
Ratio of irto ifas a function of time for eight values of tf1-(1-τ/tr)1/2is the calculated for the totally reversible system
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Ratio of ir to if as a function of time for eight values of tf 1-(1-τ/tr)1/2 is the calculated for the totally reversible system
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Working curve for -ir/if elicited from Fig. 7.
4. 결 론
진달래 전극 표면에서 일어나는 과산화수소 분해반응에 대하여 지금까지 보여준 정량적 감응과 이로부터 얻은 여러 전기화학적 파라미터들은 진달래 조직이 함유하고 있는 과산화수소 분해효소가 과산화수소의 정량분석에 활용될 수 있음을 보여주는 것이다. 한편 진달래 조직은 생활주변에서 쉽게 얻을 수 있는 것이므로 시중에서 고가로 유통되는 서양 고추냉이로부터 추출된 과산화효소를 대치할 수 있는 가능성을 연 것이다. 아울러 탄소가루 결합재로써 본 실험실에서 시도한 고무용액의 활용은 성공적이었으나 효소전극에서 공통적으로 나타나는 시간경과에 따른 감응능력의 감소 현상은 본 계에서도 여전히 숙제로 남아있다. 따라서 진달래 전극이 실용적 바이오센서로 활용되고자 한다면 효소전극의 장기 저장성에 관한 연구도 병행되어야 할 것이다.
Acknowledgements
이 논문은 2013~2014 학년도에 청주대학교 산업과학연구소가 지원하는 학술연구조성비(특별연구 추가과제)에 의하여 연구되었으며 이에 깊이 감사드립니다.
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